日糧添加發酵豆渣對母豬產仔性能、胎盤效率和胎盤營養物質轉運的影響

劉俊澤，趙靚瑜，黃凱，金曉明，李照見，李延森，李春梅

(南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

新生仔豬的體重和健康狀況在很大程度上受到子宮內環境的影響[1]。胎兒的生長高度依賴于胎盤，有研究表明，胎兒的體重與胎盤的重量成正比[2-3]。促進營養物質向胎兒的轉運是胎盤的重要功能之一[4]。胎兒的生長在很大程度上取決于養分的供應，而養分的供應則取決于胎盤的運輸能力。因此，胎盤在調節母胎資源分配，影響胎兒生長和后代的長期健康方面起著至關重要的作用。

妊娠后期是胎兒增重的關鍵階段，在妊娠后期對母豬進行營養調控來調節胎盤營養物質轉運是提高仔豬初生重的重要手段。多項研究表明，妊娠期添加微生物發酵飼料能夠提高母豬的產仔性能。經乳酸桿菌、丁酸梭菌和雙歧桿菌發酵的基礎日糧提高了母豬的窩產仔數和初生窩重[5]。益生菌發酵飼料提高了母豬的窩產活仔數和初生窩重[6]。在母豬日糧中添加8%的發酵豆粕可以顯著提高仔豬的出生窩重[7]。

豆渣是大豆在生產豆奶、豆腐、豆漿等大豆產品時的主要副產物，其營養豐富，含有豐富的脂質、蛋白和膳食纖維[8]。考慮到蛋白質飼料資源的短缺，本試驗選擇豆渣進行微生物發酵，參與發酵的微生物包括枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、釀酒酵母和糞腸球菌。在本試驗中，我們假設發酵豆渣可能會增加胎盤中營養物質轉運蛋白的表達，并改善母豬的生殖性能。因此，我們研究了胎盤的生長，母豬的繁殖性能以及胎盤氨基酸、葡萄糖轉運蛋白和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的表達。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養管理

試驗在江蘇宿遷立華種豬場進行，根據體況選擇24頭妊娠85 d的PIC母豬，胎次為4～5胎，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復1頭豬。在試驗期間，對照組(CON)飼喂基礎日糧，3個處理組飼喂添加了3%(FBD 3)，6%(FBD 6)，9%(FBD 9)發酵豆渣的基礎日糧。本試驗中使用的發酵豆渣是以40%的豆渣和60%的麥麩作為底物，原料消毒后接種混合菌液，接種比例為6%。混合菌液中嗜酸乳桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌比例為2∶2∶1∶1。發酵初始含水量為45%，發酵池密封處理，發酵溫度30～37 ℃，發酵時間48 h。發酵豆渣的化學組成如表1所示。

表1 發酵豆渣營養水平

基礎日糧根據NRC(2012)配制，發酵豆渣在添加時以濕樣形式添加，計算營養水平時以風干水平計算。日糧組成及營養水平見表2。

表2 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

2)代謝能為計算值，其余為實測值

飼喂從妊娠85 d開始，直到分娩。從妊娠85至111 d，每頭母豬每天提供3 kg日糧，在早上7:00和下午3:00分2次飼喂。之后每天飼喂量減少0.5 kg，分娩當天不飼喂。在分娩前一周，將母豬由妊娠舍(長2.2 m×寬0.65 m)轉入分娩舍(長2.2 m×寬1.5 m)。

1.2 數據記錄與樣品采集

在分娩的當天，記錄每頭母豬生產的仔豬總數，活仔數和仔豬個體重。記錄母豬產出第1只仔豬到最后1只仔豬的時間，同時記錄出生間隔。測量仔豬體長(每頭仔豬枕骨到尾根的距離)。體重指數的計算公式如下[9]：

體重指數(kg/m2) = 體重(kg)/身長(m)2

產出所有胎盤后，記錄其重量。平均胎盤重為胎盤總重量和窩產仔豬的比值，包括死胎[10]。胎盤效率為初生窩重和胎盤總重量的比值。將排出的胎盤在室溫下彼此分開，隨機選取其中3個，平鋪在方格紙上(長75 cm×寬50 cm),用中性筆描繪輪廓并計算表面積。收集距臍帶約5 cm處的胎盤組織(2 cm×2 cm)并在液氮中速凍，然后在-80 ℃下保存用于RNA提取。

1.3 實時熒光定量PCR分析

用Trizol裂解液提取豬胎盤中的總RNA，并使用NanoDrop 2000 檢測其濃度，再使用Takara反轉錄試劑盒進行合成cDNA。引物參考NCBI中GenBank公布的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計合成，由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表3。

表3 目的基因及內參基因引物

反應體系為20 μL。目的基因上、下游引物各 0.5 μL(10 μmol/L),SYBY Green real time PCR Master Mix(TaKaRa) 1 μL， DEPC水 8 μL，cDNA 1 μL。PCR反應條件：預變性(95 ℃ 60 s)；擴增(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s)，40個循環；溶解(95 ℃ 60 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s)。

1.4 統計分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，差異顯著時做Tukey組間多重比較；試驗結果以平均值和固定效應下的總標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵豆渣對母豬的產仔性能和胎盤效率的影響

由表4可知，隨著日糧中發酵豆渣含量的提高，體重指數(二次項，P=0.031)呈二次增加趨勢，個體胎盤重方面，FBD 9組的個體胎盤重較對照組和其他2個處理組的個體胎盤重顯著降低(P<0.05)。FBD 9組的胎盤效率較對照組和其他2個處理組有顯著的升高(P<0.05)。日糧中添加發酵豆渣對母豬的產程、產仔間隔、窩產仔數、窩產活仔數、胎盤面積和胎盤總重量沒有顯著影響(P>0.05)，對仔豬的初生窩重和體長沒有顯著的影響(P>0.05)。

表4 日糧添加發酵豆渣對初生仔豬狀況和胎盤性能的影響

2.2 發酵豆渣對母豬胎盤組織mTOR信號通路的影響

如圖1所示，胎盤組織mTOR的mRNA相對表達量在FBD 6和FBD 9組顯著高于CON組(P<0.05)，mTOR信號通路中4EBP1的mRNA相對表達量在3個處理組均顯著高于CON組(P<0.05)；mTOR信號通路中eIF2αmRNA相對表達量在3個處理組均顯著低于CON組(P<0.05)；同時mTOR信號通路中S6K1、eIF4EmRNA相對表達量在FBD 6和FBD 9組中顯著高于CON組(P<0.05)；RPS6的相對表達量在FBD 6組顯著低于CON組。

字母相同表示不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同圖1 發酵豆渣對母豬胎盤mTOR信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

2.3 發酵豆渣對母豬胎盤組織氨基酸轉運因子mRNA表達水平的影響

如圖2所示，胎盤組織氨基酸轉運因子LAT1mRNA相對表達量在FBD 9組顯著高于對照組和FBD 3組(P<0.05)。LAT3mRNA相對表達量在FBD 9和FBD 6組顯著高于CON組和FBD 3組(P<0.05)。4F2hcmRNA相對表達量在FBD 9 組相對表達量顯著高于CON和FBD 3組(P<0.05)，但是和FBD 組差異不顯著。SNAT1mRNA相對表達量在FBD 9和FBD 6組顯著高于CON組(P<0.05)。

圖2 發酵豆渣對母豬胎盤氨基酸轉運因子mRNA相對表達量的影響

2.4 發酵豆渣對母豬胎盤組織葡萄糖轉運因子mRNA表達水平的影響

如圖3所示，胎盤組織葡萄糖轉運因子GLUT1mRNA相對表達量在FBD 9組顯著高于CON組和其他處理組(P<0.05)。GLUT3mRNA相對表達量在3個處理組均高于CON組(P<0.05)。GLUT4mRNA相對表達量在FBD 6組高于CON組(P<0.05)，但是其他處理組和CON組差異不顯著。

圖3 發酵豆渣對母豬胎盤葡萄糖轉運因子mRNA相對表達量的影響

3 討論

仔豬初生重依賴于胎盤。有研究報道，胎兒的體重與胎盤的重量成正比[6,11]。在本研究中，FBD 9組的仔豬初生窩重平均值較對照組高了3.8 kg，但是沒有達到顯著的水平，隨著母豬日糧中發酵豆渣含量的提高，仔豬的初生窩重有線性增加的趨勢(P=0.057)。但是胎盤總重量以及個體胎盤重的數據卻呈現相反的趨勢。有報道稱當胎盤重量減少時，機體存在著補償機制來維持胎兒的體重[12]，推測是這種補償機制發揮了作用。胎盤效率是用來度量每克胎盤產生了多少克的胎兒的單位，是通過胎兒質量與胎盤重量之比來計算的[13]。胎盤效率可以通過改變母體的營養攝入量和組成來改變[14]。發酵豆渣中含有較高含量的酸溶蛋白和益生菌，利于母豬的消化吸收。在本試驗中，FBD 9組的胎盤效率要顯著高于對照組，表明FBD 9組的母豬以相同重量的胎盤可以生產更高體重的胎兒。因此推測通過在母豬日糧中添加發酵豆渣，改善母豬對營養物質的消化吸收，進而提高胎盤效率。

哺乳動物胎盤的營養物質轉運調節主要依賴mTOR信號通路。mTOR信號通路整合母體各種調節生長的信號，包括生長因子、壓力、能量水平、氧氣和氨基酸[15]。mTOR信號通路在胎盤滋養層細胞的微絨毛膜接收母體信號，并將信息傳遞至下游以改變基因轉錄和蛋白質翻譯，從而導致涉及胎兒生長的營養轉運蛋白的表達發生改變。在本試驗中，母豬日糧添加6%和9%的發酵豆渣均使mTOR下游相關基因發生了顯著的變化，所以我們進一步對母豬胎盤滋養層細胞營養轉運相關因子進行檢測。

胎盤效率高表明胎盤營養運輸效率較高[16]，葡萄糖和氨基酸是胎兒生長所必需的大量營養素，每種營養素都通過特定的轉運蛋白穿過胎盤合體滋養層細胞。胎盤表達超過15種不同的氨基酸轉運蛋白，每一種都負責攝取不同的氨基酸[17]。其中研究最多的氨基酸轉運系統是系統A和系統L。系統A是依賴鈉的累積轉運系統，可以將丙氨酸、絲氨酸和甘氨酸之類的中性小氨基酸轉運到細胞中。妊娠晚期的胎盤表達系統A的3種亞型：SNAT1、SNAT2和SNAT4。系統L是用于轉運大型中性氨基酸的交換器，它將非必須氨基酸交換為帶有分支或大側鏈的主要必需氨基酸。系統L主要包括以下4種亞型：LAT1、LAT2、LAT3和4F2hc。對胎盤氨基酸轉運因子mRNA的定量結果顯示，日糧中添加9%發酵豆渣，提高了母豬胎盤中氨基酸轉運載體LAT1、LAT3、4F2hc和SNAT1的mRNA相對表達量。表明母豬胎盤轉運氨基酸的能力得到了改善。

葡萄糖是胎兒和胎盤生長所需的主要能量底物。胎兒的糖異生很少[18]，所以胎兒幾乎完全依賴于來自母體的葡萄糖。胎盤葡萄糖轉運蛋白的豐度隨著胎盤效率的變化而變化。胎盤效率越高，胎盤中葡萄糖轉運因子的表達量越高，尤其是GLUT1和GLUT3基因的表達[14]。葡萄糖轉運蛋白GLUT1和GLUT3是將葡萄糖由母體轉運到胎兒的主要轉運蛋白[19]。而葡萄糖轉運蛋白基因GLUT4與GLUT3具有95%的同源性[20]。GLUT5是一種果糖轉運蛋白基因，它能夠在快速分裂的胚胎中表達來加強果糖的吸收以進行核酸的合成。在本試驗中，母豬日糧中添加9%的發酵豆渣提高了胎盤GLUT1和GLUT3的mRNA相對表達量。表明母豬胎盤轉運葡萄糖的能力得到了改善。總的來說，本次試驗的結果表明在妊娠后期母豬日糧中添加發酵豆渣可以提高胎盤滋養層細胞氨基酸和葡萄糖轉運因子的表達，從而提高胎盤效率。

4 結論

在妊娠后期母豬日糧中，添加9%發酵豆渣可以促進母豬胎盤組織中營養物質轉運相關基因的表達水平，促進母體營養向胎兒運輸，從而提升胎盤效率，最終提高仔豬初生窩重。