牛支原體貴州株表面膜蛋白p81基因生物信息學(xué)分析

謝曉東，李濤，袁海文，文明,3，周碧君,2，楊美,3，程振濤,3*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008；3. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025 )

牛支原體(Mycoplasmabovis)是引起牛支原體肺炎的主要病原，M.bovis感染除引起牛支原體肺炎外，還會(huì)引起耳炎、結(jié)膜角膜炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎癥、乳腺炎、流產(chǎn)等癥狀，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[1]。牛支原體黏附素主要以膜蛋白形式存在于細(xì)胞表面，對牛支原體的致病性起重要作用。而在牛支原體膜表面蛋白眾多研究熱點(diǎn)當(dāng)中，Vsp蛋白因?yàn)槠淇乖砦缓痛笮《季哂懈哳l的變異性而研究資料較多[2-3]。Vsp 蛋白家族是一組與牛支原體黏附性密切相關(guān)的膜脂質(zhì)蛋白，它能夠協(xié)助牛支原體黏附在宿主細(xì)胞上，從而產(chǎn)生相關(guān)的致病性。此外，牛支原體還有pMB67、P26抗原、28 kD蛋白等其他黏附相關(guān)蛋白[4]。牛支原體膜表面蛋白的研究對揭示該病原致病與免疫機(jī)理有重要意義[5]，p81蛋白為牛支原體的表面膜蛋白，研究資料認(rèn)為其也是一種特異性抗原蛋白，p81蛋白有高度的保守性且種間差異較大[7]，如牛支原體PG45株的p81蛋白與無乳支原體的p81蛋白的同源性只有64%。2009年，我國學(xué)者李媛等[6]選用p81基因設(shè)計(jì)引物，建立了牛支原體雙重PCR方法。此方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，因而牛支原體p81基因可以作為靶向基因用來診斷牛支原體。本文通過對牛支原體貴州株p81基因的克隆，測序及生物信息學(xué)分析，獲取牛支原體貴州株p81基因分子特征，為基于p81蛋白致病性、免疫防控和診斷研究提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 菌株

M.bovisGZ01、M.bovisGZ02由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；M.bovis標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45(ATCC25533)購自美國典型菌種保藏中心。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購自Biomiga公司，2×Taq PCR Master Mix、200 bpDNA Maker購自北京天根生化科技有限公司，pMD-19T載體購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司，DNA限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司。

1.3 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)NCBI公布牛支原體基因序列設(shè)計(jì)一對引物，上游引物p81-p1：5′-TTATTTAAGAATTTGACTTGAT-3′；下游引物p81-p2：5′-GAAAAATAAATTAATGATTGGGCTT-3′，預(yù)擴(kuò)增片段長2 187 bp，由大連寶生物工程有限公司合成。提取2株牛支原體貴州分離株和牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45基因組，應(yīng)用引物p81-p1/ p81-p2對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 p81基因克隆及序列分析

將PCR擴(kuò)增的目的基因膠回收與純化，純化的基因與pMD-19T載體連接轉(zhuǎn)化入宿主菌，對重組載體進(jìn)行PCR及酶切鑒定。陽性重組質(zhì)粒由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。采用DNAStar 7.1和Mega 5.0軟件對牛支原體貴州株p81基因進(jìn)行氨基酸推導(dǎo)及進(jìn)化關(guān)系分析。

1.5 p81基因生物信息學(xué)分析

采用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/compute PI/MW)和Protparam(http://web.expasy.org/protparam)分析預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)及氨基酸組成；采用在線軟件Protscale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/)分析蛋白疏水性與親水性；采用在線軟件SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services.SingnalP)和TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白信號肽以及預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；采用在線軟件NetNGlyc 1.0、NetPhos 2.0和NetPhosk 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/)預(yù)測蛋白潛在N糖基化位點(diǎn)、潛在磷酸化位點(diǎn)以及保守的特異性蛋白激酶作用位點(diǎn)；采用在線軟件PHD sec(http://www.predictprotein.org/)和(Immune Epitope Database,IEDB)(http://www.iedb.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；利用DNAStar 7.1提供的蛋白質(zhì)氨基酸序列抗原表位在線預(yù)測工具，進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 p81基因PCR 擴(kuò)增

以提取的牛支原體培養(yǎng)物DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得牛支原體貴州株p81基因，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。PCR擴(kuò)增獲得大小約為2 187 bp目的條帶(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增片段相符。

M.DL 2000 Marker；1、2. 牛支原體GZ01；3、4. 牛支原體GZ02；5、6. 牛支原體PG45；7.空白對照圖1 p81基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 p81基因PCR 克隆及序列分析

2.2.1 陽性重組質(zhì)粒篩選

牛支原體GZ01、牛支原體GZ02 p81目的基因經(jīng)膠回收純化、連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定(圖2)，可見從重組質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得約為2 187 bp的目的條帶，與目的基因大小一致。

M.DL 2000 Marker；1、2、3. 牛支原體GZ01 p81基因重組質(zhì)粒；4、5、6. 牛支原體GZ02 p81基因重組質(zhì)粒；7.陰性對照圖2 陽性重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.2.2 陽性重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳電泳結(jié)果見圖3。重組質(zhì)粒雙酶切可見約2 187 bp的目的基因條帶和2 962 bp的載體條帶，結(jié)果證實(shí)，目的基因克隆成功。

M.DL 2000 Marker；1. 牛支原體GZ01 p81基因重組質(zhì)粒；2. 牛支原體GZ02 p81基因重組質(zhì)粒；2、4.陰性對照圖3 陽性重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2.3p81基因推到氨基酸序列分析

經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，對氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)分析。由圖4可見，p81基因序列編碼728個(gè)氨基酸，推導(dǎo)氨基酸55 位、230 位、485 位、558位密碼子為TGA，可作為終止密碼子，但對于牛支原體p81基因?yàn)樯彼?，如進(jìn)行蛋白表達(dá)需進(jìn)行位點(diǎn)突變。將2株M.bovis貴州株氨基酸序列與參考株P(guān)G45氨基酸序列進(jìn)行比較顯示, 2株分離自貴州省不地區(qū)的M.bovis貴州株氨基酸序列完全相同，但與PG45株p81蛋白氨基酸序列發(fā)生110位點(diǎn)突變。此結(jié)果表明，貴州省內(nèi)M.bovis菌株p81蛋白保守，但相較于標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45株已出現(xiàn)明顯進(jìn)化。

圖4 牛支原體貴州株p81基因推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 p81蛋白理化性質(zhì)的分析

應(yīng)用ExPASy(Compute PI/MW)、Protparam在線分析軟件預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及氨基酸組成。p81蛋白分子質(zhì)量為 81.629 6 kD，分子結(jié)構(gòu)式為C3643H5795N963O1133S13。理論等電點(diǎn)為9.15。其氨基酸組成中Lys(K)最多，占13.5%，含有1個(gè)Cys(C)(0.1%)，堿性氨基酸有3種(Arg、His、Lys)，共121個(gè)，占16.6%；推測p81為堿性蛋白。該蛋白溶液中不穩(wěn)定指數(shù)為29.15，低于閾值40，在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。這些指數(shù)提示p81蛋白應(yīng)具有較好的抗原性。

2.4 p81蛋白疏水性及親水性的預(yù)測與分析

應(yīng)用Protscale在線預(yù)測牛支原體貴州流行株p81氨基酸序列的親疏水性，結(jié)果見圖5。

圖5 p81基因親疏水性分析

圖中縱坐標(biāo)大于0的為疏水區(qū)，得分越高疏水性越強(qiáng)；反之，則為親水區(qū)。p81基因編碼的蛋白多肽鏈第18位具有最高分，為2.156(疏水性最強(qiáng))，在616位具有最低分，為-3.178(親水性最強(qiáng))。Scale分析得知，整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性，較好的親水性也預(yù)示著較高的可溶性。

2.5 p81蛋白信號肽及跨膜區(qū)預(yù)測

應(yīng)用在線軟件SignalP 4.0和TMHMM 2.0分析此蛋白信號肽以及預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖6。牛支原體貴州株p81基因所編碼氨基酸在24～25間具有分泌信號肽的特征，因此表達(dá)時(shí)建議該蛋白基因進(jìn)行修飾。由圖7可知，該蛋白不具有明顯的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，有利于提升p81基因表達(dá)效果。

圖6 p81信號肽分析

圖7 p81跨膜區(qū)分析

2.6 p81蛋白修飾結(jié)構(gòu)的預(yù)測

應(yīng)用在線軟件采用在線軟件NetNGlyc1.0、NetPhos 2.0和NetPhosk1.0 預(yù)測蛋白潛在N糖基化位點(diǎn)、潛在磷酸化位點(diǎn)以及保守的特異性蛋白激酶作用位點(diǎn)。由圖8可知，p81蛋白在第167，314，328，493和559個(gè)氨基酸處共存在5個(gè)N糖基化位點(diǎn)；p81蛋白有59個(gè)絲氨酸、29個(gè)蘇氨酸及11個(gè)酪氨酸可能被磷酸化。上述磷酸化位點(diǎn)所對應(yīng)的磷酸激酶預(yù)測結(jié)果顯示，在p81蛋白上可能有PKC，UNSP，PKA，CKⅠ，DNAPK，RSK，INSR，CKⅡ，PKG，SRC，cdc2，ATM，EGFR共13種保守的特異性蛋白激酶的結(jié)合位點(diǎn)，其中在451處unsp得分最高為0.997。這些分析結(jié)果提示p81蛋白與牛支原體致病性存在相關(guān)關(guān)系。

圖8 p81蛋白修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 p81蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用在線軟件PHD sec和SWISSMODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，Sec預(yù)測組p81蛋白多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的3種類型分別是α-螺旋(H)、β-折疊(S)和無規(guī)則卷曲(L)，比率分別為27.61%、11.40%和60.99%，以無規(guī)則卷曲為主，β-折疊較少。利用SWISS-MODEL預(yù)測p81基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖9所示，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相似。

圖9 p81蛋白三級結(jié)構(gòu)模型

2.8 p81蛋白B細(xì)胞抗原表位分析

采用Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Jamson-Wolf以及Emini方法，分別對p81蛋白的表面可及性、抗原指數(shù)、親水性、柔韌性進(jìn)行預(yù)測。由圖10可見，該蛋白存在豐富的親水性區(qū)域，主要集中在27～168、312～546、645～716。p81蛋白有多個(gè)表面可及性程度高的肽段，分別是31～142、557～628。其他部分表面可及性較小，但均為正值。骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域，且分布相對均勻。該蛋白整體抗原指數(shù)較高，120～168、428～484較大，其中25～169、196～292、426～628區(qū)域抗原優(yōu)勢明顯，上述區(qū)域可作為蛋白表達(dá)選擇的目標(biāo)區(qū)域。

圖10 p81蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

3 討論

牛支原體感染可造成養(yǎng)牛業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且其感染已呈現(xiàn)世界性分布[8]，因此國內(nèi)外均加強(qiáng)了牛支原體地方流行株的研究。牛支原體感染的主要癥狀為咳嗽、呼吸困難，從開始流清亮鼻液到后期轉(zhuǎn)為黏性或者膿性鼻液，剖檢可見胸腔積液、與肺部發(fā)生粘連、肺臟質(zhì)地變硬并出現(xiàn)壞死灶[9-10]。目前對牛支原體診斷較為困難，常用方法主要為牛支原體病原分離鑒定和基因檢測[11-12]。但在病原分離培養(yǎng)時(shí)，由于牛支原體對營養(yǎng)需求較高，耗時(shí)長，臨床分離易受其他微生物污染，因此不能作為臨床快速診斷手段[13]；而針對牛支原體基因和血清抗體檢測，因其高通量、高靈敏性和快速高效特性，常被應(yīng)用于臨床診斷技術(shù)，但此方法以特異性基因和抗原蛋白的選擇為基礎(chǔ)。因此，開展牛支原體相關(guān)功能蛋白基因的生物信息學(xué)分析，是有效選擇靶標(biāo)蛋白的手段，也是構(gòu)建亞單位疫苗或基因工程疫苗的必備步驟。吳燕等[14]通過對綿羊支原體肺炎p113基因生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)p113蛋白可能是潛在信號通路分子，也是一種良好的抗原結(jié)構(gòu)蛋白；對豬支原體A1基因編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在跨膜區(qū)域，具有良好抗原性[15]。因此，本研究選擇牛支原體p81基因，開展目的基因的序列分析，推導(dǎo)分析氨基酸的特性，為基于牛支原體p81基因的表達(dá)、亞單位疫苗構(gòu)建、診斷試劑和致病性研究提供可行性分析資料。

牛支原體不具有細(xì)胞壁，其細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層和膜蛋白組成，牛支原體主要通過支原體細(xì)胞膜成分發(fā)揮致病作用，包括支原體黏附、增殖、入侵宿主細(xì)胞、免疫應(yīng)答等[16-18]。目前的研究資料認(rèn)為，p81應(yīng)為牛支原體膜蛋白[19]，具有開展診斷試劑、基因工程疫苗、亞單位疫苗研究的可能性。本文通過對牛支原體貴州株p81基因擴(kuò)增，并分別進(jìn)行推導(dǎo)氨基酸編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、預(yù)測二級與三級結(jié)構(gòu)以及B細(xì)胞抗原表位分析，結(jié)果均提示，p81蛋白具有作為抗原蛋白的優(yōu)勢。本研究還發(fā)現(xiàn)，55位、230位、485位、558位密碼子為TGA，可作為終止密碼子，但牛支原體p81基因?yàn)樯彼幔邕M(jìn)行蛋白表達(dá)需進(jìn)行位點(diǎn)突變；高黎萍[20]在進(jìn)行p25、p33蛋白表達(dá)時(shí)，為使基因能在在大腸桿菌中進(jìn)行正確表達(dá)而將TGA突變?yōu)榫幋a色氨酸的TGG，最終成功或獲得p25、p33目的蛋白。針對抗原蛋白的體外表達(dá)，需要考慮表達(dá)量、表達(dá)蛋白區(qū)段抗原指數(shù)、信號肽區(qū)域、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域等因素選擇合適的表達(dá)區(qū)段。本文對M.bovisp81蛋白的B細(xì)胞抗原表位、信號肽區(qū)域、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域分析顯示，p81蛋白在24～25位氨基酸區(qū)域存在信號肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，其中25～169、196～292、426～628區(qū)域抗原優(yōu)勢明顯，綜上分析，認(rèn)為對p81蛋白表達(dá)如選擇N端區(qū)域，需考慮去除信號肽，并對可能存在TGA進(jìn)行突變。而如選擇包含426～628的C端進(jìn)行表達(dá)，則需對存在的TGA進(jìn)行突變。