補飼精料對大青山絨山羊瘤胃細菌及產甲烷菌多樣性的影響

楊碩，盧洋洋，韋玥瑞，史彬林，娜仁花

(內蒙古農業大學動物科學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

內蒙古地區具有豐富的家畜與草場資源，草地畜牧業是該地區重要的經濟支柱，也是我國主要的綠色有機畜牧產品生產基地。2016年內蒙地區羊出欄量為5 971.3萬只,產絨量為8 498.23 t，分別占全國的19.45%和45.10%[1]。大青山絨山羊作為正在培育的一個肉絨兼用新品種，具有較穩定的遺傳性能和較高的生產性能，在內蒙古地區具有不可替代的養殖地位以及經濟價值。大青山絨山羊常年以自然放牧為主，然而受冬季寒冷因素影響，該地區牧草枯黃期長，導致放牧條件下絨山羊營養攝入不足，嚴重影響其產肉和產絨的生產性能。相關研究表明，冬季補飼精料可顯著提高歐拉型藏羊日增重，增強過冬度春的能力[2]；而且，補飼精料后肉品質及屠宰性能均顯著提高[3-4]。因此，在枯草期進行放牧與補飼合理結合，是實現放牧絨山羊營養均衡的主要措施。但是，日糧類型的改變勢必會對瘤胃微生物區系產生重要影響。補飼可顯著提高放牧羊瘤胃微生物多樣性，且瘤胃微生物數量也隨著補飼精料后發生顯著性變化[5-6]。本研究利用高通量測序技術研究放牧大青山絨山羊瘤胃微生物的多樣性以及補飼對瘤胃微生物多樣性帶來的影響。為研究大青山絨山羊瘤胃微生物(細菌、甲烷菌)多樣性提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與試驗地點

試驗于2016年11月中旬至12月中下旬，在內蒙古呼和浩特市土左旗大青山種羊場進行。

1.2 試驗設計與樣品采集

試驗選用年齡1歲、體重(38.2±1.6)kg的大青山絨山羊(羯羊)10只，經檢疫和驅蟲后，飼養觀察7 d。試驗分放牧組(natural grazing, NG)和補飼組(grazing with supplementary feeding, GS)，每組5只。自然放牧組每天10:00至17:00期間在天然草場進行放牧，補飼組在自然放牧的基礎上每天18:00補飼精料1次，每只補飼0.5 kg。整個試驗期分為預飼期22 d和試驗期7 d，共29 d。羊舍環境及飼養管理保持一致。試驗結束時禁食12 h后，將瘤胃液樣品采集器經羊的口腔、食道插入瘤胃內，進行體外采集瘤胃液，經4層紗布過濾后，迅速投入液氮保存以備DNA提取。

1.3 日糧和牧草營養成分組成

采用劃區分點采樣方法，采集地面可食用部分的牧草，經粉碎混勻后，采用四分法獲得分析樣品。補飼的精料購自呼和浩特市新凱飼料廠。主要采食的牧草營養組分及補飼精料營養組分見表1。

表1 絨山羊主要采食牧草的營養水平(干物質基礎) %

1.4 瘤胃微生物DNA提取

參照文獻[7]提供的珠磨—十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法，提取瘤胃液中總DNA，經酶標儀和瓊脂糖凝膠電泳測定每個樣品DNA濃度及條帶完整性，-20 ℃保存備用。

1.5 熒光定量PCR擴增與Illumina HiSeq測序

以瘤胃微生物總DNA為模板，對16S rDNA V3至V4區進行擴增，建立DNA文庫，所用細菌、甲烷菌的通用引物分別為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)； 1106F (F:5′-TTWAGTCAGGCAACGAGC-3′)和1378R (R:5′-TGTGCAAGGAGCAGGGAC-3′)。PCR反應體系：2.5 μL引物(上游引物、下游引物各1.25 μL)，12.5 μL 2×Phusion Master Mix，2 μL模板DNA，和8.0 μL ddH2O。反應參數：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和qPCR定量，文庫合格后，使用HiSeq 2500 PE250進行上機測序。

1.6 數據處理與生物信息學分析

利用Uparse 軟件對所有樣品的全部 Effective Tags進行聚類，以97%的一致性(Identity)，將序列聚類，使之成為可執行分類操作單位(Operational Taxonomic Units，OTUs)。用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1)，獲得分類學信息，并分別在各個分類水平上，使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計算Chao1、Shannon，使用R軟件進行Alpha多樣性指數組間差異分析。通過將觀察到的OTUs數量除以估計的最大OTUs數量來計算當前的百分比覆蓋率。經Excel 2007對放牧組和補飼組樣品菌群的相對豐富度進行統計，然后采用SAS 9.2統計軟件并進行T檢驗，以P<0.05作為差異性顯著性判定標準。

2 結果與分析

2.1 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液細菌多樣性的影響

經Illumina HiSeq高通量測序和數據質量控制，除去接頭序列、低復雜序列和低質量序列后， 兩組細菌和產甲烷菌OTUs數以及α多樣性見表2。在細菌種水平上，補飼組中Shannon指數低于放牧組，差異極顯著(P<0.01)，其他OTUs數量和Chaol指數均無顯著差異性(P>0.05)；在甲烷菌種水平上，補飼精料組OTUs數、Chaol指數顯著高于放牧組(P<0.05)，Shannon指數差異不顯著(P>0.05)。

表2 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中微生物多樣性的影響

2.2 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃微生物相似性比較分析

對放牧組與補飼組瘤胃微生物在門水平上的相似性利用非加權配對算術平均法(UPGMA)進行聚類分析，結果如圖1所示。放牧組大青山絨山羊瘤胃微生物能清晰的與補飼組相區分，即在細菌門水平上(圖1A)各放牧組間相似性較高，聚在一起；各補飼組間相似性較高，聚集在一起形成另一簇。同樣，在產甲烷菌門水平上(圖1B)放牧組與補飼組形成2大簇。該結果說明由補飼引起的日糧品質的改變，對瘤胃內微生物豐度產生了一定的影響。

注：NG，放牧組;GS，補飼組圖1 瘤胃微生物門水平上相似性聚類分析

2.3 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中細菌多樣性的影響

補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中細菌多樣性的影響見表3。大青山絨山羊瘤胃液中細菌在門水平上主要是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)。與對照組相比，補飼組擬桿菌門細菌豐度極顯著高于放牧組(P<0.01)，而且變形菌門細菌豐度也顯著升高(P<0.05)，但厚壁菌門細菌豐度顯著低于放牧組(P<0.05)；放牧組中的互養菌門(Synergistetes)細菌豐度顯著高于補飼組(P<0.05)；補飼對其他菌門無顯著性影響(P>0.05)。

表3 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃細菌菌群豐度的影響(門、科水平)

選取每個樣品在科水平上最大豐度排名前6的物種，分別為普雷沃氏菌科(Prevotellaceae) 、韋榮球菌科(Veillonellaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和互養菌科(Synergistaceae)。補飼精料組顯著增加了瘤胃液中普雷沃氏菌科細菌豐度(P<0.01)，但顯著降低于韋榮球菌科、瘤胃球菌科、理研菌科以及互養菌科細菌豐度(P<0.05)。其他菌科間并無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中產甲烷菌多樣性的影響

補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中產甲烷菌區系在科水平上組成的影響見表4。可鑒定到科水平的大青山絨山羊瘤胃產甲烷菌主要為甲烷桿菌科、甲烷八疊球菌科、甲烷微菌科。補飼組瘤胃液中甲烷桿菌科顯著高于放牧組(P<0.05)，而甲烷八疊球菌科和甲烷微菌科顯著低于放牧組(P<0.05)。另外，放牧組與補飼組瘤胃液中未鑒定的甲烷菌科分別占41.14%、39.33%。

大青山絨山羊瘤胃產甲烷菌在屬水平上的差異見表4。甲烷短桿菌屬為絕對優勢菌屬，且補飼組顯著高于放牧組(P<0.05)，分別占總產甲烷菌屬的59.97%、47.76%。放牧組中的甲烷微球菌屬顯著高于放牧組(P<0.05)，而甲烷球形菌屬低于補飼組，差異趨于顯著(P=0.06)。另外，將不屬于任何已知屬的甲烷菌標注為未分類甲烷菌，分別占放牧組和補飼組的45.97%、39.53%。

表4 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃產甲烷菌菌群豐度的影響(科、屬水平)

3 討論

3.1 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中細菌多樣性的影響

分析瘤胃液樣品的OTUs數量和α多樣性，其結果可以反映微生物群落的豐度和多樣性。本研究通過HiSeq測序發現，補飼精料組大青山絨山羊瘤胃液細菌OTUs數量低于放牧組，分別為1 357、1 289。表明不同飼養條件下大青山絨山羊瘤胃微生物種類均很豐富。但本試驗的OTUs數量低于陳蕓等[8]對黑山羊的研究結果。這可能由于不同宿主動物進化歷程的差異性所致，同時與絨山羊的生存環境、所處地理位置、草場類型不同也存在關系。另外，補飼組的特征指數Chao1、ACE、Shannon均低于放牧組，表明在補飼精料的過程中，粗蛋白、淀粉等含量的增加對瘤胃微生物結構有重要影響。

瘤胃細菌是瘤胃中最多樣化的群體，能夠利用纖維、淀粉、蛋白質和糖，在動物健康和生產性能中具有重要作用[9]。本研究對絨山羊瘤胃細菌群落分析顯示，瘤胃擬桿菌門和厚壁菌門為主要的優勢菌，其他菌門豐度相對較少，這與過去對反芻動物的許多研究一致[10]。在門水平上，與放牧組相比補飼精料使擬桿菌門增加了19.61%，然而厚壁菌門豐度降低了18.03%。曾燕[11]報道與本試驗中絨山羊不同，認為綿羊瘤胃內相對豐度最高的為厚壁菌門(44.37%)，蒙古羊瘤胃相對豐度最高的為擬桿菌門(67%)。韓旭峰等[12]研究發現，80～110日齡陜北絨山羊瘤胃微生物以厚壁菌門為主。以上結果表明，瘤胃細菌菌群結構受反芻動物品種、日齡等因素的影響，其群落結構發生變化。另外，補飼精料后變形菌門豐度顯著增加，林波等[13]在對水牛瘤胃微生物的研究中也有相似發現。有研究發現，初生(1～3 d)犢牛和乳汁補充日糧飼養的2月齡犢牛瘤胃中變形菌門的豐度最高，6月齡后奶牛瘤胃中變形菌門的豐度急劇下降[14]。這一結果可能是因為犢牛在斷奶后攝入飼糧中蛋白含量降低，纖維含量升高引起的。在本試驗中，放牧組牧草蛋白含量較低，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量較高，而補飼的精料中具有較高的蛋白含量以及較低的纖維含量，因此推測變形菌門的豐度隨纖維含量的增加而減少，并且與日糧中的蛋白含量呈正相關。有研究發現，變形菌門主要包括的屬為假單胞菌，多數假單胞菌能夠產生角蛋白酶，該酶具有很強的蛋白質降解功能[15]。該觀點可為上述假設提供一定的輔助性參考。本試驗進一步在科水平上的研究發現，擬桿菌門中的普雷沃氏菌科，厚壁菌門中的韋榮球菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科與上述變化具有相同的趨勢。這些豐度的差異，可能是因日糧中纖維含量的不同造成的[16]。普雷沃氏菌科在兩組中為優勢菌，且補飼精料后顯著增加了豐度。與前人研究結果對比分析發現，普雷沃氏菌的豐度并不總是隨著日糧的變化而表現出規律性變化。有人發現飼喂干草組山羊瘤胃中的普雷沃氏菌豐度高于精料組[17]。然而，也有人認為，雖然不同日糧組綿羊瘤胃中普雷沃氏菌的豐度差異不顯著，但與粗糧組相比，精料組中普雷沃氏菌呈上升趨勢[18]。這一結果與本試驗的研究結果具有相似性。普氏菌中有許多種類，它們參與半纖維素、果膠、淀粉和蛋白質的降解[19]。由于普雷沃氏菌的種類和對底物的偏好不同，日糧結構的變化并不一定會引起普雷沃氏菌豐度的規律性變化。瘤胃球菌由白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌兩種強纖維消化細菌組成，可產生大量的纖維素酶和半纖維素酶。受底物誘導的影響，纖維含量越高，瘤胃球菌的豐度越高[20]。據報道，瘤胃毛螺菌在消化纖維過程中與產琥珀酸絲狀桿菌具有協同作用[21]。然而，由于分離培養困難，對毛螺菌的生理特性理解不夠深入[22]，其在纖維消化中的作用有待進一步研究。

3.2 補飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中產甲烷菌多樣性的影響

產甲烷菌廣泛存在于反芻動物胃腸道中，在維持瘤胃代謝及功能方面發揮著重要作用[23]。有人提出，瘤胃產甲烷菌的特定性可能與宿主飼料轉化效率有關；然而，由于可用于發酵的食物變化，日糧化學組成極大地影響瘤胃中甲烷的生成[24]。因此，本試驗試圖通過高通量測序技術，對比放牧與補飼條件下大青山絨山羊瘤胃產甲烷菌的群落結構。

在瘤胃中，古菌占所有微生物的4%[25]。本研究也發現，產甲烷菌α多樣性指數遠小于細菌，但隨補飼精料后產甲烷菌豐度發生改變，特別補飼組中的OTUs數量以及Chao1指數顯著高于放牧組。產甲烷菌作為專性厭氧古菌，不能直接利用復雜有機物，只能利用瘤胃細菌、原蟲和真菌的發酵產物(H2、CO2、甲酸鹽等)作為能量來源，所以，受飼養環境、飼料組成及飼喂方式等因素影響較大。本試驗在產甲烷菌科水平上研究表明，大青山絨山羊瘤胃內產甲烷菌以甲烷桿菌科為主。這與國內外報道在其他反芻動物上的研究結果一致[26-27]。補飼精料后甲烷桿菌顯著提高，通過屬水平分析可知，甲烷短桿菌屬、甲烷球形菌屬、甲烷桿菌屬是甲烷桿菌的主要成員，它們能夠利用H2還原甲醇。在瘤胃中，甲醇是原蟲水解果膠和細菌酯酶活性的產物。牧草是一種相對較差的日糧果膠來源，而精料中一些成分，如柑橘和甜菜果肉中含有豐富的果膠。有人研究發現，當飲食中的精料部分增加時，原蟲數量會增加， 造成瘤胃內可用甲醇量增加[28]。因此，補飼精料可能是通過甲醇含量的變化造成甲烷桿菌豐度的升高。已有報道稱，豐度較低的微生物在不同環境中發揮重要作用，即使這些基因型僅占所有基因型的3%，依然在代謝效率方面起到重要調節作用，最終導致寄主飼料利用率和宿主甲烷排放的變化[29]。雖然本研究中放牧組甲烷微球菌屬豐度較低，但有可能是產生甲烷的主要菌群，補飼顯著降低了其豐度，從而引起瘤胃甲烷生成的減少。利用qPCR對16S rRNA基因進行分析，發現甲烷的產量主要歸因于產甲烷菌數量的變化[30]。因此，補飼精料引起甲烷菌豐度的變化是否與甲烷產量的變化有直接關系仍需進一步的探討。本研究發現未知產甲烷菌屬占很高的比例，達到39.53%以上。這些數據說明，瘤胃產甲烷菌群落結構的龐大信息遠超出我們的認知范圍，仍需進一步探索。

4 結論

在細菌門水平上，放牧組和補飼組存在共同的優勢菌群即擬桿菌門和厚壁菌門，補飼提高了擬桿菌門含量，降低了厚壁菌門含量。在科水平上，放牧組和補飼組豐度最高的均為普氏菌科，補飼后瘤胃球菌科、理研菌科和互氧菌科豐度顯著降低。

古菌中甲烷桿菌科及甲烷短桿菌屬受補飼精料的影響顯著升高，而甲烷八疊球菌科和甲烷微球菌屬顯著降低。