豬圓環病毒3型ORF2基因的截短表達及間接ELISA抗體檢測方法的建立

何博，王勤，歐云文

(1. 達州職業技術學院，四川 達州 635001；2. 開江縣動物疫病預防控制中心，四川 達州 636250；3. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046)

豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬(Circovirus)。目前已知的PCV分為3種基因型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1致病性弱，一般不引起細胞病變；PCV2在豬群中普遍存在，致病性較強；PCV3是一種新發現的豬圓環病毒，2016年在美國首次發現[1]。近年來我國的山東、湖北、廣西等多個省市豬群中也陸續檢測出PCV3[2-4]。研究表明，感染PCV3可能引起豬皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙、多系統炎癥、仔豬先天性震顫等多種疫病，是當前威脅養豬業健康發展的一個潛在致病原[5-6]。PCV3基因組結構與PCV2相似，為單鏈環狀DNA病毒，基因組全長約為2 000 bp，主要有3個開放閱讀框(ORF1、ORF2和ORF3)，其中ORF1基因編碼含有296個氨基酸的復制酶(Rep蛋白)，ORF2基因編碼含有214個氨基酸的衣殼蛋白(Cap蛋白)，ORF3基因編碼含有230個氨基酸的蛋白(目前該蛋白功能未知)[7-8]。ORF2基因編碼的Cap蛋白是PCV-3的唯一結構蛋白，存在病毒主要抗原決定簇，可誘導機體產生中和抗體，且PCV3與PCV1和PCV2ORF2基因不具有共同的線性抗原表位[9-10]。以ORF2基因編碼的Cap蛋白作為診斷抗原可實現PCV3與PCV1、PCV2特異性抗體的鑒別檢測。鑒于此，本研究進行了PCV3ORF2基因的截短表達，并以重組蛋白為包被抗原，建立了檢測PCV3抗體的間接ELISA方法。同時將其初步應用于四川地區豬場的臨床樣品檢測，旨在掌握PCV3在四川地區的陽性感染率，為PCV3的臨床鑒別診斷和血清學監測提供了一種敏感性強、特異性高、適合大規模樣品檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與抗體

PCV3陽性病料、PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、乙型腦炎病毒(JEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等病毒陽性血清均由本校動物傳染病實驗室保存。PCV3陽性血清采集于臨床感染PCV3的發病豬血清，PCV3陰性血清采集于臨床未感染致病原、未吃初乳的新生仔豬血清。

1.2 試劑與試劑盒

原核表達載體pET-32a(+)、Premix Taq酶、BamHⅠ和HindⅢ內切酶、T4 DNA連接酶、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞、核酸提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；HRP標記兔抗豬IgG購自美國Solarbio公司；DAB與TMB底物顯色液均購自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-NTA蛋白純化試劑盒購自南京金斯瑞公司。

1.3 引物設計

參照GenBank中PCV3基因組序列(GenBank登陸號為MF069115)設計1對擴增引物，片段大小為348 bp并包含ORF2基因主要抗原表位，上游引物F：5′-ATAGGATCCTTCCGCATAAGG-3′；下游引物R：5′-ATTCAAGCTTCCAAGGAGACGACGAC-3′，引物序列中陰影部分分別為BamHⅠ和HindⅢ酶切位點序列。

1.4 ORF2基因PCR擴增

利用核酸提取試劑盒提取PCV3陽性病料的核酸DNA，利用合成的引物進行ORF2基因主要抗原區域的PCR擴增。PCR擴增反應體系為：2×Premix Taq 25 μL、核酸DNA 5 μL、上游引物F 0.5 μL、下游引物R 0.5 μL、水18 μL。PCR擴增反應程序為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。

1.5 pET-32a-ORF2載體的構建與鑒定

利用BamHⅠ和HindⅢ，分別對ORF2基因PCR擴增產物與原核表達載體pET-32a進行雙酶切。酶切產物經膠回收試劑盒回收純化后，利用T4 DNA連接酶于4 ℃過夜連接，次日轉化DH5α感受態細胞。質粒提取試劑盒提取重組質粒，經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確后命名為pET-32a-ORF2，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析，驗證閱讀框架是否正確。

1.6 重組蛋白的表達與純化

將測序分析正確的重組質粒pET-32a-ORF2轉入BL21(DE3)感受態細胞，利用IPTG進行誘導表達。將表達菌體利用超聲波裂解，離心裂解產物，12 000 r/min離心10 min。分別采集離心后的上清和沉淀進行SDS-PAGE，鑒定重組蛋白的表達形式。對以包涵體形式表達的重組蛋白，利用Ni-NTA蛋白純化試劑盒對重組蛋白進行純化，純化蛋白經SDS-PAGE檢測純化效果。

1.7 重組蛋白的Western blot鑒定

重組蛋白和pET-32a空載體蛋白經SDS-PAGE后轉印至硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉封閉2 h。洗滌后加入40倍稀釋的PCV3陽性血清，37 ℃感作45 min，洗滌后加入3 000倍稀釋的HRP標記兔抗豬IgG，37 ℃感作30 min，洗滌后加入DAB顯色液感作5 min。

1.8 間接ELISA檢測方法的建立

1.8.1 間接ELISA操作方法

將重組蛋白適當稀釋后，4 ℃過夜包被ELISA反應板，洗滌后加入適當稀釋的血清樣品(一抗)，37 ℃感作適當時間，洗滌后加入適當稀釋的HRP標記兔抗豬IgG(二抗)，37 ℃感作適當時間，洗滌后加入TMB底物顯色液，37 ℃感作適當時間，2 mol/L H2SO4終止反應，在波長450 nm處測定OD值。

1.8.2 間接ELISA最佳反應條件的確定

抗原最佳包被量和一抗最佳稀釋度的確定：將重組蛋白稀釋至終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 μg/mL，將一抗分別進行1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍稀釋，采用方陣滴定法確定抗原的最佳包被量和一抗最佳稀釋度。

最佳封閉液和最佳封閉時間的確定：分別選擇5%脫脂奶粉、10%脫脂奶粉、1% BSA、3% BSA作為封閉液，封閉液作用時間分別為30、60、90 min，采用方陣滴定法確定最佳封閉液和最佳封閉時間。

二抗最佳稀釋度和最佳作用時間的確定：將HRP標記兔抗豬IgG分別進行1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000倍稀釋，HRP標記兔抗豬IgG作用時間分別為30、60、90 min，采用方陣滴定法確定二抗最佳稀釋度和最佳作用時間。

一抗最佳作用時間的確定：在相同試驗條件下，將一抗分別作用30、60、90 min，根據陽性血清和陰性血清比值(P/N值)，確定一抗最佳作用時間。

底物最佳作用時間的確定：在相同試驗條件下，將TMB底物分別作用5、10、15 min，根據陽性血清和陰性血清比值(P/N值)，確定底物最佳作用時間。

1.8.3 間接ELISA臨界值的確定

1.9 間接ELISA敏感性試驗

將PCV3陽性血清分別進行1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240、1∶20 480、1∶40 960倍系列稀釋，以各稀釋度作為一抗進行ELISA檢測，確定對PCV3陽性血清的最低檢出效價。

1.10 間接ELISA特異性試驗

分別選取已知的PCV3陽性血清和陰性血清、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV和TGEV等病毒陽性血清，利用間接ELISA方法依次進行檢測，確定方法的特異性。

1.11 間接ELISA重復性試驗

批內重復性試驗：用同一批次制備的純化蛋白包被ELISA板，分別在4個不同時間點對6份PCV3抗體水平不同的血清樣品進行檢測，統計檢測結果并計算變異系數，確定間接ELISA方法的批內重復性。

批間重復性試驗：用不同批次制備的4批純化抗原分別包被ELISA反應板，并分別在4個不同時間點對6份PCV3抗體水平不同的血清樣品進行檢測，統計檢測結果并計算變異系數，確定間接ELISA方法的批間重復性。。

1.12 間接ELISA臨床樣品檢測試驗

2018年至2019年，在四川地區的32個豬場采集了533份不同飼養階段和用途的臨床豬血清樣品。應用間接ELISA方法進行檢測，評估當前四川地區的PCV3感染情況，確定間接ELISA方法的臨床適用性。

2 結果與分析

2.1 ORF2基因PCR擴增結果

如圖1所示，利用合成的針對ORF2基因引物，可以對PCV3陽性病料核酸DNA擴增出1條特異性條帶，大小為348 bp，與試驗預期的擴增片段大小相符。

M. DL 2000 DNA Marker；1. PCV3陽性病料；2. 水對照圖1 PCR擴增結果

2.2 pET-32a-ORF2載體的構建與鑒定結果

如圖2所示，pET-32a-ORF2重組質粒通過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，可分別獲得2條特異性條帶，大小約為5 900 bp和348 bp。對該重組質粒的測序結果表明，其閱讀框架完全正確。

M. DL 15000 DNA Marker；1. 重組質粒的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切產物圖2 重組質粒雙酶切鑒定結果

2.3 重組蛋白的表達與純化

如圖3所示，重組質粒pET-32a-ORF2轉入BL21(DE3)感受態細胞后，利用IPTG誘導獲得了以非可溶蛋白形式大量表達的重組蛋白，并經Ni-NTA蛋白純化試劑盒純化后獲得了高純度的純化蛋白。

M. 蛋白Marker；1. pET-32a-ORF2未誘導菌；2. pET-32a載體誘導菌；3. pET-32a-ORF2誘導菌；4. 上清；5. 沉淀；6. 純化后蛋白圖3 重組蛋白表達與純化的SDS-PAGE

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定

如圖4所示，重組蛋白可與PCV3陽性血清發生特異性結合反應，說明重組蛋白具有良好的反應原性。

M. 預染蛋白Marker；1. 純化蛋白與PCV3陽性血清反應；2. pET-32a載體誘導菌與PCV3陽性血清反應圖4 Western blot鑒定結果

2.5 間接ELISA最佳反應條件的確定

2.5.1 抗原最佳包被量和一抗最佳稀釋度的確定

當抗原包被量為0.8 μg/mL，一抗稀釋度為1∶40時，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0。經方陣滴定法確定抗原的最佳包被量為0.8 μg/mL，一抗最佳稀釋度為1∶40。

2.5.2 最佳封閉液和最佳封閉時間的確定

當封閉液為1% BSA和封閉時間為60 min時，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0。經方陣滴定法確定最佳封閉液為1% BSA，最佳封閉時間為60 min。

2.5.3 二抗最佳稀釋度和最佳作用時間的確定

當HRP標記兔抗豬IgG稀釋倍數為1∶4 000，作用時間為30 min時，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0。經方陣滴定法確定二抗最佳稀釋度為1∶4 000，二抗最佳作用時間為30 min。

2.5.4 一抗最佳作用時間的確定

在相同試驗條件下，當一抗作用60 min時，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0，故確定一抗最佳作用時間為60 min。

2.5.5 底物最佳作用時間的確定

在相同試驗條件下，當TMB底物作用10 min，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0，故確定底物最佳作用時間為10 min。

2.6 間接ELISA臨界值的確定

2.7 間接ELISA敏感性試驗

如表1所示，當PCV3陽性血清進行1∶20 480倍稀釋時，間接ELISA檢測其OD450值為0.356，呈陽性反應。間接ELISA對PCV3陽性血清的最低檢出效價可達1∶20 480。

表1 間接ELISA敏感性試驗結果

2.8 間接ELISA特異性試驗

如表2所示，間接ELISA檢測PCV3陽性血清為陽性，而檢測PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV和TGEV等病原的陽性血清均為陰性?？梢姡g接ELISA方法具有很好的特異性。

表2 間接ELISA特異性試驗結果

2.9 間接ELISA重復性試驗

2.9.1 批內重復性試驗

6份血清樣品經過同一批次純化蛋白，在4個不同時間點檢測，變異系數最低為2.52%，最高為3.75%，見表3。試驗結果說明，間接ELISA方法具有良好的批內重復性。

表3 批內重復性試驗結果

2.9.2 批間重復性試驗

6份血清樣品經過4批次純化蛋白，在4個不同時間點進行檢測，變異系數最低為3.52%，最高為4.18%，見表4。試驗結果說明，間接ELISA方法具有良好的批間重復性。

表4 批間重復性試驗結果

2.10 間接ELISA臨床樣品檢測試驗結果

應用間接ELISA方法對533份臨床豬血清樣品進行PCV3抗體檢測，共檢測出PCV3抗體陽性的樣品79份，PCV3陽性感染率達14.82%，其中種豬、仔豬、育肥豬的陽性感染率分別為29.22%、8.11%、9.79%，見表5。表明當前四川地區存在一定程度的PCV3感染，尤其是種豬中PCV3的感染情況較嚴重。

表5 臨床檢測結果

3 討論

目前針對PCV3的研究處于起步階段，尚無病毒成功分離報道，加強對PCV3感染的診斷和流行病學監測對其綜合防控至關重要。由于PCV3與PCV2引起的臨床癥狀極其相似，故對于PCV3的診斷應依靠實驗室鑒別診斷方法。當前，對于PCV3的實驗室鑒別診斷方法主要有分子生物學診斷方法和血清學診斷方法，其中PCR[11]、套式PCR[12]、熒光定量PCR[13]、環介導等溫擴增技術(LAMP)等分子生物學方法能夠檢測到PCV3特定的核苷酸序列，具有敏感性高、特異性強、準確性好等特點，在豬場進行PCV3和PCV2感染的臨床鑒別診斷中得到了廣泛應用，并取得了良好的應用效果[14]。但分子生物學方法檢測成本高，檢測一次的數量有限，僅適合發病豬場的實驗室確診，不適合大批量樣品或大面積范圍的流行病學監測。而ELISA等血清學診斷方法操作簡單、檢測周期短、檢測成本低、通量高，特別適合大批量樣品或大面積范圍的血清學監測。由于PCV3的全病毒抗原制備過程繁瑣，且存在非常高的生物安全危險性，故利用基因工程技術體外制備人工抗原成為研究的熱點，為新型血清學診斷試劑的研發提供了方向。在體外制備人工抗原中，表達系統的合理選擇至關重要，由于原核表達系統具有成本低、試驗周期短、表達量大、重組蛋白易于純化等優勢，其一直是異源蛋白體外表達的首選系統。本研究選擇大腸桿菌原核表達系統，對PCV3中OPR2基因編碼的Cap蛋白，也是PCV3的唯一衣殼蛋白進行了體外表達，后續試驗結果證實，截短表達的Cap蛋白表達量較大，易于純化，且具有良好的反應活性，以其作為包被抗原建立的間接ELISA檢測方法，對PCV3陽性血清的最低檢出效價可達1∶20 480，檢測PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV、TGEV等8種豬病病毒陽性血清均為陰性，批內和批間重復性試驗的變異系數均小于5%，顯示出了良好的敏感性、特異性和重復性。

鑒于過去PCV2對我國養豬業造成的巨大危害，PCV3一開始流行就引起了我國研究者的高度重視。為確定PCV3在我國不同地區的感染情況，近年來研究人員陸續對國內不同地區PCV3感染情況進行了流行病學監測。何長生等[15]采用熒光定量PCR方法對采集于安徽省3個地區12個豬場的239份樣品進行了PCV3檢測，PCV3陽性感染率為14.6%；趙宇等[16]采用PCR方法對河南不同地區豬場的152份臨床樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性感染率為30.26%；劉相聰等[17]利用PCR技術對廣東、廣西、海南、福建、江西、湖南177家規模化豬場的1 078份樣品進行檢測PCV3陽性感染率為29.04%。本研究利用間接ELISA方法，對2018至2019年四川地區32個豬場采集的533份臨床豬血清樣品進行PCV3抗體檢測，共檢測出PCV3抗體陽性樣品79份，PCV3陽性感染率達14.82%，顯著低于趙宇等[16]、劉相聰等[17]的檢測結果，與何長生等[15]的檢測結果基本相同，表明當前四川地區存在一定的PCV3感染，但相對于國內其他地區仍然較低，這與四川省多年來一直重視加強生物安全防控措施密不可分。鑒于PCV3的流行態勢，進一步加強對PCV3感染的綜合防控仍刻不容緩。何長生等[15]研究表明，保育豬、育肥豬、后備母豬、能繁母豬、種公豬PCV3陽性感染率分別為0%、2.9%、44.4%、51.9%和25.0%。本研究中發現種豬、仔豬、育肥豬的陽性感染率分別為29.22%、8.11%、9.79%，該結果與何長生等[15]的調查結果基本一致。上述研究結果說明，不同豬群均存在PCV3感染，以種豬最易感，該情況需引起足夠重視，對于PCV3的防控應重點加強對種豬的控制。

綜上，本研究利用大腸桿菌原核表達系統截短表達的OPR2基因主要抗原區域，具有良好的反應活性，以其作為包被抗原建立的間接ELISA檢測方法具有良好的敏感性、特異性、重復性和臨床適用性，顯示出了良好的臨床應用前景。