徐州地區豬源大腸桿菌血清型調查和耐藥檢測

昌莉麗，裴淑麗，李華坤，孫朋，王海軍，王玉燕

(1. 徐州生物工程職業技術學院，江蘇 徐州 221006；2. 河南農業職業學院，河南 中牟 451450)

作為豬肉消費大國，養豬業在我國發展迅速，規模化豬場逐漸增多，同時也對豬場飼養管理和疾病防控提出更高要求。大腸桿菌作為繁殖和定居在腸道內致病菌，很容易隨糞便排出體外污染環境。一旦環境改變，豬場飼養管理不當，仔豬抵抗力下降就會引起仔豬腹瀉，造成大腸桿菌病在豬場流行。目前，對該病的防治臨床多采取疫苗預防和藥物治療，但在防治上還存在問題。一方面大腸桿菌血清型種類眾多，難以確定抗原的血清型，造成疫苗免疫的針對性差和有效保護不足；另一方面多重耐藥菌株的產生又使藥物療效大打折扣導致臨床不能有效防治。為了掌握本地區豬場大腸桿菌血清型分布和耐藥情況，2015年6月至2019年8月，對徐州周邊17個中小規模養豬場和屠宰場進行病料采集和大腸桿菌分離鑒定，并進行藥敏試驗和血清型鑒定，為本地豬場大腸桿菌病防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料和樣本采集

采集病料和樣本共117份。分別來自銅山、邳州、蕭縣等17個豬場或屠宰場。2015年至2017年，主要采集具有臨床癥狀的病仔豬十二指腸和直腸糞便，2018年和2019年采集病豬直腸肛門處糞便，以及飼料和飲水樣本。

1.2 主要試劑

營養肉湯培養基、LB肉湯培養基、麥康凱瓊脂培養基(即用型)、M-H瓊脂培養基(即用型)、營養瓊脂培養基(即用型)均由杭州微生物試劑有限公司生產。大腸桿菌O抗原定型血清型購于天津生物芯片技術有限責任公司。藥敏紙片由BIO-KONT 溫州市康泰生物科技有限公司生產，藥敏質控菌株大腸桿菌ATCC25922株，來自于河南牧業經濟學院友情饋贈，本實驗室保存。細菌基因組DNA提取試劑盒、2倍HStaq master mix、DL2000 Marker、DL5000 Marker、引物設計合成均由江蘇溥博生物科技有限公司合成。

1.3 實驗動物

昆明種小鼠240只，體重18～23 g，徐州醫科大學動物實驗中心提供。

1.4 臨床菌株分離和初步鑒定

無菌分離病仔豬十二指腸腸道內容物或直腸肛門糞便接種于LB肉湯培養基增菌培養，置37 ℃恒溫培養箱培養16～18 h，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基(即用型)，37 ℃培養18 h，挑取粉紅色疑似菌落接種于營養肉湯培養基培養18 h,再次劃線接種于尹紅美蘭培養基(即用型)37 ℃培養18 h，挑取黑色疑似菌落，分別接種于營養肉湯培養基和營養瓊脂培養基(即用型)37 ℃培養18 h 后，置于4 ℃冰箱保存待用。菌液經鑒定后作為臨床分離株制備甘油菌，-20 ℃保存備用。挑取營養瓊脂平板單菌落涂布于載玻片，經革蘭氏染色后，光學顯微鏡下鏡檢進行形態學觀察。

1.5 病原菌特異性PCR鑒定

取1 mL LB肉湯過夜震蕩培養的新鮮菌液，參照細菌基因組提取試劑盒的說明書方法，提取細菌基因組DNA,作為分離菌株PCR鑒定的DNA模板。參照文獻[1]設計引物，Ecoli-F:CGATTCTGAAAT-GGCAAAAG,Ecoli-R:CGTGATCAGCGGTGACTAT-GAC,由江蘇溥博公司科技有限公司合成。PCR反應條件為94 ℃熱變性5 min,94 ℃解鏈30 s,52～60 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共進行35個循環。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，預期擴增片段長度為750 bp。

1.6 病原菌O抗原血清型鑒定

將鑒定后的菌株接種于營養瓊脂斜面培養基37 ℃過夜培養，用0.5%石碳酸生理鹽水2 mL沖洗細菌菌落，收集密封在5 mL玻璃瓶內并用生理鹽水稀釋至1×1010CFU/mL，121 ℃高壓滅菌2 h，作為待檢抗原備用。移液槍吸取O抗原單因子血清1滴到玻片上，再取1滴待檢抗原加入血清，立即混勻，靜置5 min后觀察結果，如果出現凝集則為陽性。以待測抗原和生理鹽水混合液作為空白對照，排除細菌自凝現象。

1.7 毒力試驗

毒力試驗參照文獻[2]。選取體重均勻，20 g左右健康小鼠，隨機分為80組，每組3只，從中分出1個對照組和2個試驗組。取待檢菌株，接種于營養肉湯培養基，過夜培養18 h后，取菌液稀釋至1010CFU/mL作為待檢菌液，試驗組小鼠腹腔接種待檢菌液0.3 mL/只，對照組腹腔接種同劑量滅菌肉湯，隔離飼養，觀察小鼠發病和致死情況，統計發病率和死亡率。以每組3只小鼠全部死亡判定為強毒力毒株，2只小鼠死亡判定為中等毒力毒株，1只小鼠死亡判定為低毒力毒株。無小鼠死亡判定為無毒力毒株。同時剖檢死亡小鼠，觀察病變并取病料接種麥康凱瓊脂培養基分離培養，染色鏡檢，鑒定大腸桿菌。

1.8 藥敏試驗

采用K-B紙片法[3]，對臨床分離的有致病性大腸桿菌進行耐藥性測定。結果判斷按照CLSI推薦的標準，以標準菌株大腸桿菌ATCC25922株為參照物，根據抑菌圈直徑(D)判斷結果。D>16 mm為敏感，D<10 mm為耐藥， 16 mm>D>10 mm為中介。

2 結果與分析

2.1 臨床菌株分離和初步鑒定

經過初步分離培養和初步鑒定，117份樣本分離到大腸桿菌102株(表1)，所分離的大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養基上長出紫紅色圓形菌落；在伊紅美藍培養基上長出黑色金屬光澤菌落；在營養瓊脂培養基上長出灰白色半透明光滑的圓形菌落；營養肉湯培養基培養試管底部有白色沉淀，管口有菌環，菌液混濁。病原菌染色后鏡檢(圖1)，可發現兩端鈍圓，散在分布紅色短桿菌，說明分離菌株為革蘭陰性無芽孢桿菌。

表1 樣品來源及大腸桿菌分離率

2.2 病原菌特異性PCR鑒定

將所分離鏡檢后的臨床菌株進行特異性PCR鑒定，均能擴增到750 bp的目的條帶(圖2)。

1.大腸桿菌ATCC25922株； 2～9.臨床分離菌株；M.DNA分子量標準 (DL2000)圖2 臨床分離菌株PCR鑒定

2.3 病原菌O抗原血清型鑒定

在分離的102株臨床大腸桿菌中，除21株未能鑒定出血清型、2株自凝外，余下79株均能發生凝集，可鑒定為O抗原，占檢測菌株的77.4%，分屬18 個血清型。其中O15、045、O78、O138 4種血清型分別占已定型血清的17.7%，11.4%，13.9%，12.6%，合計占已定型菌株的55.6%。由此說明，O15、O45、O78、O138為徐州周邊地區的優勢血清型(見表2)。

2.4 毒力試驗

小鼠經攻毒后12 h相繼表現精神食欲不振，呼吸加快，拉稀、死亡，剖檢可見肝脾腫大、出血，涂片染色鏡檢可見兩端鈍圓、單個或散在的的革蘭陰性桿菌，劃線接種麥康凱培養基可見粉紅色圓形菌落。80組小鼠，對照組和2個試驗組全部存活，余下77組均為致病菌株。其中25株菌接種后小鼠全部死亡，占31.6%，主要分布在O15(5株)、O25(1株)、O78(3株)、O44(2株)、O138(5株)、O126(1株)、O45(6株)、O141(2株)血清型，說明這些菌株具有很強的致病力。中等毒株 38株，占48.1%；弱菌株14株，占17.7%，說明這些臨床分離菌株具有不同程度的致病性，一旦條件具備就會引發疾病。

2.5 耐藥試驗結果及多重耐藥率分析

采用K-B紙片法，量取不同藥物藥敏片抑菌圈直徑并進行統計分析。結果顯示(表3)，2015至2019年間臨床分離保存有致病性的77株大腸桿菌，對20種藥物均有不同程度的耐藥性，其中耐藥率在50%以上的藥物多達17種，占到了臨床常用藥物的85%；其中阿莫西林、氨芐西林鈉、強力霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、乳酸環丙沙星臨床耐藥尤其嚴重，高達80%以上；耐藥率比較低在50%以下的藥物僅有頭孢曲松、頭孢噻呋、氨曲南3種藥物。此外，所分離的77株致病性菌株均表現出了多重耐藥性，至少耐藥12種以上，其中12耐和13耐菌株所占比例最大，分別為25.9%和22.1%，耐藥譜型多達8種，常見耐藥譜為氨芐西林鈉-阿莫西林-強力霉素-氟苯尼考-阿奇霉素-鹽酸林可霉素-慶大霉素-新霉素-痢菌凈-復方新諾明-恩諾沙星-乳酸環丙沙星。

表3 2015年至2019年臨床分離菌株對20種藥物的耐藥率分析

3 討論

通過對徐州周邊豬場大腸桿菌進行分離鑒定、血清型調查和耐藥檢測，發現徐州地區豬源大腸桿菌分離率高，血清型復雜，耐藥率高且具有多重耐藥性。在采集的117份樣本中，分離到102株大腸桿菌，檢出率高達87.2%，提示該病原在本地各豬場廣泛存在。對大腸桿菌的分離鑒定，本研究放棄傳統的生化鑒定，在選擇性培養基初篩、細菌形態觀察的基礎上，直接進行大腸桿菌特異性PCR鑒定，快速準確。PCR法可進行大批量樣本檢測，適用于臨床疾病的流行病學調查；經血清型和致病性檢測，檢出O抗原血清型大腸桿菌79株，分屬18 個血清型，檢出率77.4%，致病毒株達到97.4%，提示血清型眾多的O抗原菌株仍為臨床常見流行菌株，并且不同血清型菌株之間存在不同程度的毒力差異。已定型菌株中O15、O45、O78、O138為優勢血清型占55.6%，其中O45、O15、O138 3種血清型致病力較強，占強毒株的64.0%，充分說明O抗原血清種類和致病性有一定聯系，這和文獻報道的結論一致[5-6]。 結合近年報道的相關血清型監測結果，發現除O138血清型檢出率略高外，各地區檢測優勢血清型均有不同[5-7]。提示在徐州地區可針對性地選擇與O15、O45、O78和O138 4種血清型相吻合疫苗預防接種，以提高豬免疫效果；耐藥檢測結果發現，臨床菌株不僅耐藥嚴重還表現出多重耐藥性，這和很多文獻對豬源大腸桿菌耐藥性的報道一致[6-8]。說明菌株耐藥性增加是成為各大集約化豬場共同面臨的重要問題。本研究臨床菌株耐藥達12種以上，對阿莫西林、氨芐西林鈉、強力霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、乳酸環丙沙星等臨床常用藥耐藥率高達80%以上，說明這些藥物在徐州地區臨床應用泛濫，已不適合進一步作為豬大腸桿菌病防治用藥，豬場應引起重視并考慮選用相對敏感的頭孢曲松、頭孢噻呋、氨曲南、多黏菌素、卡那霉素等藥物。目前，豬場常用治療藥物，受成本、適口性、藥殘等因素限制，臨床可供選擇的藥物已經有限，但日趨嚴重的耐藥性又進一步導致臨床幾乎無藥可用。因此，克服耐藥性，開發新獸藥，尋找新的抗生素替代品，改進用藥方式，都將是未來解決這一難題的重要途徑。

多年來，仔豬大腸桿菌病一直是困擾養豬業的一個難題，雖然臨床采取多種防治措施減少大腸桿菌病的發病率和死亡率，但至今未能完全杜絕。該病之所以難治，與菌株眾多血清型和日趨嚴重的耐藥性密切相關[10-11]，因此，菌株血清型和耐藥性的定期檢測對指導本地豬場大腸桿菌病的防治至關重要。