磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽合成工藝的優(yōu)化

李 雪，金學(xué)平，曾祥聰，李 爽，李 麗，余 磊，朱伶俐，周 委，祝 宏*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢430205；

2.武漢市藥物增溶工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢430205；

3.武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢430205

磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽是磷霉素類藥物的關(guān)鍵中間體，包括磷霉素鈣、磷霉素鈉以及磷霉素氨丁三醇［1-3］。磷霉素類藥物主要用于敏感菌所致的單純性下尿路感染和腸道感染，通過與細(xì)菌烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)移酶不可逆結(jié)合，抑制其活性，阻斷N-乙酰葡糖胺和磷酸烯醇丙酮酸合成N-乙酰胞壁酸，干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，發(fā)揮廣譜抗菌作用［4-5］。多重耐藥菌的出現(xiàn)和流行使臨床抗感染治療面臨日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)［6-8］，磷霉素抗菌機(jī)制獨(dú)特，交叉耐藥少，對于多種臨床重要耐藥菌仍有較高的抗菌活性，再度得到臨床醫(yī)師的重視［9-10］。

原研工藝采用Glamkowski合成法，進(jìn)行手性拆分生產(chǎn)磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽，收率達(dá)32.5%，該工藝存在混旋鹽拆分過程操作繁瑣、能耗大，拆分技術(shù)不易掌握，收率不穩(wěn)定等問題［11-12］。近年來有文獻(xiàn)相繼報(bào)道了以鎢酸鈉或鉬酸鈉催化順丙烯膦酸-（R）-（+）-α-苯乙胺鹽環(huán)氧化合成磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的工藝，收率在28%～30%，該類工藝解決了混旋鹽拆分繁瑣的問題，但收率并沒有提升，且使用的催化劑存在回收困難，殘留嚴(yán)重等問題，有著很大的改進(jìn)空間［13-15］。

本文在上述基礎(chǔ)上，以過氧樹脂為載體，負(fù)載鎢酸鈉制備成高分子手性環(huán)氧催化劑R（圖1），經(jīng)驗(yàn)證具有良好的性能，并且能夠多次重復(fù)套用；通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對合成條件進(jìn)行優(yōu)化，以順丙烯膦酸為原料，反應(yīng)溫度、催化劑用量、原料物質(zhì)的量之比、反應(yīng)時(shí)間作為影響因素，收率、光學(xué)純度作為評價(jià)指標(biāo)，找到了最佳的合成方案［16-18］，解決了催化劑回收困難問題，提高了反應(yīng)收率［19-21］；采用紅外光譜，光學(xué)純度分析，液相色譜法聯(lián)用蒸發(fā)光散檢測器（high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector，HPLC-ELSD），核磁共振氫譜（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）對其進(jìn)行質(zhì)量分析［22-23］，該方案制備工藝簡單、穩(wěn)定、質(zhì)量可控，適合用于工業(yè)化生產(chǎn)［24-25］。

圖1磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的合成路線Fig.1 Synthesis route of phosphonomycin（R）-1-phenylethylamine salt

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52C；ZF7三用紫外分析儀；RY-1熔 點(diǎn) 儀；AuTopolIV（365 nm）；Agilent-Cary630；Agilent1260Ⅱ。

1.1.2 試劑順丙烯膦酸，（R）-（+）-α-苯乙胺，乙醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%雙氧水，水合鎢酸鈉、Na2HPO4，以上（湖北迅達(dá)藥業(yè)股份有限公司）；過氧樹脂［賽樂成爾（武漢）科技有限公司］。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 催化劑R的制備稱取50.0 g水合鎢酸鈉加至1 000 mL三口燒瓶中，加入500 mL純化水?dāng)嚢柚寥芮澹徛渭?0 mL的H2SO4（6 mol/L），得白色乳濁液，再滴加4.0 mL磷酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%）；向反應(yīng)體系中加入過氧樹脂50.0 g，劇烈攪拌并升溫至60℃，反應(yīng)8 h后降至室溫，減壓抽濾，濾餅用大量純化水洗至濾液為中性，然后再用100 mL無水乙醇淋洗2次，將濾餅轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱50℃至無減重，得亮黃色固體85.2 g，催化劑負(fù)載量為70.4%。

1.2.2 順丙烯膦酸-α-苯乙胺鹽的合成用量筒取50 mL（0.164 mol）順丙烯膦酸溶液，加至250 mL三口瓶中，補(bǔ)加70 mL乙醇，勻速攪拌；緩慢勻速滴入（R）-（+）-α-苯乙胺21 mL（0.164 mol），控制溫度低于40℃；滴加完畢，40℃恒溫快速攪拌反應(yīng)1.5 h，于零攝氏度以下抽濾，濾餅用環(huán)己烷（50 mL）洗滌3次，轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱50℃至無減重，得灰白色固體38.72 g，收率97.1%。

1.2.3 磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的合成在250 mL三頸瓶中，加入上步驟全部產(chǎn)物固體38.72 g（0.148 mol）的順丙烯膦酸-α-苯乙胺鹽和120 mL乙醇，攪拌并升溫至45℃，直至固體全部溶清；在攪拌的條件下慢慢加入催化劑3.0 g（相當(dāng)于順丙烯膦酸質(zhì)量的15%），Na2HPO40.12 g（相當(dāng)于順丙烯膦酸質(zhì)量的6‰），然后用恒壓滴液漏斗慢慢滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的雙氧水23 mL（0.197 mol），控制滴速約5秒/滴。滴加完畢，升溫至65℃恒溫反應(yīng)3 h，趁熱抽濾，回收催化劑，濾液送至冰箱冷凍析晶5 h，再次抽濾，濾餅送至鼓風(fēng)干燥箱50℃干燥至恒重，得白色結(jié)晶狀固體22.1 g，收率53.8%。［文獻(xiàn)［11］：收 率32.5%DMF）］；1HNMR（400 MHz，D2O）δ：1.19～1.20（d，J=4.0Hz，3H，CH3），1.35～1.37（d，J=8.0Hz，3H，CH3），2.64～2.69（d，J=10.0Hz，1H，CH），3.01～3.08（m，1H，CH），4.23～4.27（m，1H，CH），7.19（s，5H，ArH）；IR（KBr）v：3 178.11，1 626.66，1 534.58，1 148.40，1 046.68，908.79，847.08，772.83，700.52 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 工藝條件的優(yōu)化

2.1.1 磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的合成單因素試驗(yàn)經(jīng)過大量預(yù)試實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)順丙烯膦酸與（R）-（+）-α-苯乙胺的物質(zhì)的量之比、成鹽反應(yīng)溫度、催化劑的用量、反應(yīng)時(shí)間對磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的合成試驗(yàn)結(jié)果影響較明顯；因此，以順丙烯膦酸與（R）-1-苯乙胺的物質(zhì)的量之比（n1∶n2）、反應(yīng)溫度（C）、催化劑用量（B）、反應(yīng)時(shí)間（A）作為單因素考察條件，按上述實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行試驗(yàn)，以收率（Y）和光學(xué)純度（ee%）作為參考指標(biāo)，探索該反應(yīng)的較為合適的條件。單因素試驗(yàn)因素及試驗(yàn)條件見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

表1單因素試驗(yàn)因素及試驗(yàn)條件Tab.1 Factors and levels for single factor experiment

由圖2可知，反應(yīng)時(shí)間在2～3 h、催化劑用量在10%～20%、反應(yīng)溫度在55～65℃、原料順丙烯膦酸與（R）-（+）-α-苯乙胺物質(zhì)的量比為1∶1.0～1∶1.5之間時(shí)，產(chǎn)率較高?？紤]綜合成本，順丙烯膦酸與（R）-（+）-α-苯 乙 胺 的物質(zhì) 的 量 比 采用1∶1.1～1∶1.3作為最佳范圍。

2.1.2 磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的合成正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以收率（Y）、光學(xué)純度（ee%）作為考察指標(biāo)，選擇四因素三水平正交表L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，為了使試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析準(zhǔn)確度進(jìn)一步提高，隨機(jī)設(shè)置各因素水平，用來安排正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平，具體見表2。

圖2單因素試驗(yàn)結(jié)果：（a）反應(yīng)時(shí)間，（b）催化劑用量，（c）反應(yīng)溫度，（d）原料物質(zhì)的量比Fig.2 Results of single factor experiment：（a）reaction time，（b）amount of catalyst，（c）reaction temperature，（d）molar ratio of raw material

表2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.2 Factors and levels for orthogonal test design

2.1.3 工藝條件優(yōu)化的分析此步所有條件及操作不變，原料為第3步所得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

以50 mL母液（含順丙烯膦酸20.0 g）為原料，按照1.2和表2的條件進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，分別測定產(chǎn)品收率和對映體過量百分率e.e.值，進(jìn)行多指標(biāo)綜合評分。在合成物質(zhì)純度較高的條件下，產(chǎn)率是合成條件優(yōu)良與否的主要評價(jià)指標(biāo)，因而設(shè)權(quán)重系數(shù)為0.7，e.e.值越低，則表明產(chǎn)物的光學(xué)純度越低，所以設(shè)權(quán)重系數(shù)為0.3。以綜合評價(jià)的結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析，結(jié)果見表3、表4和表5。

以綜合評價(jià)為指標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)選取條件的范圍內(nèi)，以A、B、C、D四個(gè)因素作為變量，進(jìn)行方差分析，無Sig.值和F值，D項(xiàng)的Ⅲ型平方和為0.137，遠(yuǎn)小于其他3個(gè)因素，所以將D因素作為誤差項(xiàng)分析，不列入變量范圍，再次進(jìn)行方差分析，得到表5結(jié)果。

表3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal test design

表4第一次方差分析結(jié)果Tab.4 First analysis results of variance

將D因素作為誤差項(xiàng)進(jìn)行分析，A、B、C三項(xiàng)的Sig.值分別為0.02、0.03、0.01，均小于0.05，可認(rèn)為因素A、B、C對綜合評價(jià)的影響顯著，即反應(yīng)時(shí)間、催化劑的用量、反應(yīng)溫度對綜合評價(jià)指標(biāo)影響顯著，且影響強(qiáng)度：反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞催化劑的用量；順丙烯膦酸與（R）-（+）-α-苯乙胺的物質(zhì)的量之比對綜合評價(jià)指標(biāo)幾乎沒有影響。根據(jù)極差分析結(jié)果和方差分析結(jié)果以及從節(jié)約成本、提升光學(xué)純度等方面來判斷，最佳的合成工藝條件為A3B2C3D1，即反應(yīng)時(shí)間3.0 h，催化劑用量質(zhì)量15%，反應(yīng)溫度65℃，順丙烯膦酸與（R）-（+）-α-苯乙胺的物質(zhì)的量為1∶1.0。

2.2 催化劑R活性驗(yàn)證

參照實(shí)驗(yàn)1.2.3，以最佳的合成工藝條件（即反應(yīng)時(shí)間3.0 h，催化劑用量質(zhì)量15%，反應(yīng)溫度65℃，順丙烯膦酸與（R）-（+）-α-苯乙胺的物質(zhì)的量為1∶1.0）進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，并將粗品以質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇-水溶液精制，烘干得產(chǎn)出精品經(jīng)HPLC檢測純度達(dá)99%以上視為合格，其中催化劑R經(jīng)重復(fù)利用5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

根據(jù)表6數(shù)據(jù)可知，該步反應(yīng)平均收率為48.7%，催化劑R重復(fù)套用5次，其催化活性基本上保持一致，很好的解決了催化劑難以回收的問題。

表6催化劑R重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Experimental results for catalyst R recycle

表5第二次方差分析結(jié)果Tab.5 Second analysis results of variance

3 結(jié)論

本研究在原研工藝Glamkowski合成法的基礎(chǔ)上，綜合了近年來以鎢酸鈉或鉬酸鈉催化順丙烯膦酸-（R）-（+）-α-苯乙胺鹽環(huán)氧化合成磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的工藝，通過修飾催化劑并改變投料比、反應(yīng)時(shí)間、催化劑用量以及溫度等實(shí)驗(yàn)因素，找到較優(yōu)反應(yīng)條件。

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［L9（34）］，以產(chǎn)率和光學(xué)純度為考察指標(biāo)，利用綜合評分法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知，反應(yīng)時(shí)間3.0 h，催化劑用量15%，反應(yīng)溫度65℃，順丙烯膦酸與（R）-（+）-α-苯乙胺的物質(zhì)的量為1∶1.0為磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的最優(yōu)合成條件。通過對上述條件的優(yōu)化，以順丙烯膦酸為原料制備磷霉素（R）-1-苯乙胺鹽的綜合收率達(dá)47.3%，與現(xiàn)有工藝（30%～35%）相比有所提升，并解決了催化劑難以回收的問題。此合成路線具有經(jīng)濟(jì)、易操作的特點(diǎn)，且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。