苗藥小花清風藤葉內生真菌Alternaria enuissima 的鑒定

周永強 易國蓮 王宇婷 葉 蘭 王小雪 趙春麗*

（貴州中醫藥大學 藥學院，貴州 貴陽550025）

植物內生真菌是一類存在植物的組織中以細胞內或細胞間的方式生長，而不會對它們造成任何有害影響的微生物[1]。在長期的自然選擇下與宿主植物形成和諧的共生關系，“內共生理論”認為植物內生真菌能產生與其宿主相同或相似的物質[2]，并且植物內生真菌是一個種類多、分布廣的生物類群，具有極其豐富的種屬多樣性和功能多樣性，同一種植物或是同一株植物中可以分離出多個不同種屬的內生真菌[3]。從內生真菌中尋找和發掘人類可利用的資源，不僅對人類社會的健康發展也對自然生態保護有著十分重大的意義。

小花清風藤（Sabia parviflora Wall. ex Roxb.）是一種來自被子植物門雙子葉植物綱無患子目清風藤科清風藤屬的常綠木本藤本植物的干燥莖和葉。它的根、莖、葉皆可以用作藥物，在貴州西南部常用于治療黃疸型肝炎和風濕性疼痛，療效好，具有很高的藥用價值。此外，小花清風藤具有許多生物活性，因此對它的開發利用極為重要[4]。然而，由于開荒導致小花清風藤資源日益匱乏，滿足不了市場需求，因此尋找能夠替代宿主植物產生藥效成分的內生真菌意義重大。最近研究發現，內生真菌可以促進寄主植物的生長和抗逆性，產生多種與寄主植物相同或相似的二次代謝產物，是影響藥材真實性的關鍵因素[5-7]。對從小花清風藤莖中篩選出內生真菌進行類群分析，通過研究內生真菌的多樣性，或可找到與宿主具有相同的或含有相似活性成分（如抗病毒性肝炎成分等）的菌株，并可發現許多擁有抗人類疾病活性的藥物能應用于醫藥業行業中，可用于開發和利用。

1 材料

1.1 供試菌株

小花清風藤內生真菌菌株L-43 是從小花清風藤葉中分離得到，保存在在貴州中醫藥大學中藥民族藥實驗室。

1.2 主要試劑

Tris 飽和酚購于北京索萊寶科技有限公司；EDTA-2Na 購自國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇購于天津市富宇精細化工有限公司；引物V9D 和引物LS266 均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；NaCl 購于成都金山化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器

基因擴增儀（JY-96G）購自君意電泳公司；振蕩培養箱（BS-1EA）常州市華普達儀器有限公司；雙面單人凈化工作（SW-CJ-2FD）購自浙江蘇凈凈化有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器（DS-280KB30）購自上海申安醫療器械廠。

2 方法

2.1 內生真菌L-43 的形態學鑒定

從斜面挑取各真菌，分別接種于培養基上，使用恒溫培養箱在28℃下培育。按照菌落和菌絲的形態特點進行歸類與鑒別，觀察其菌落大小、顏色、表面特征、質地等。無菌條件下在培養基上以45°角插入2 片蓋玻片，并用接種針從斜面挑取少量菌絲接種，置于28℃恒溫培養箱中培養。用光學顯微鏡觀察各菌落和菌絲，是否有孢子及分生孢子梗，對照《真菌鑒定手冊》進行形態學鑒定[8]。

2.2 內生真菌L-43 的分子鑒定

將在無菌條件下，將純化好的小花清風藤葉內生真菌L-43接于PDB 培養基中，在150rpm 搖床培養箱中于28℃下培養4-5 天后，過濾，并用無菌水沖洗獲得菌體。放入研缽，加入液氮研磨成粉，加入DNA 提取試劑進行提取，采用引物V9D 和LS266 對提取后的DNA 進行ITS 序列擴增，擴增后將PCR 擴增片段進行測序。結果在NCBI 數據庫BIAST 對比已知種屬的ITS序列進行相似性分析，再運用MEGA5.0 分析其系統發育，構建進化樹，而后進行數據處理和生物多樣性分析[9]。

3 結果與分析

3.1 小花清風藤葉內生真菌L-43 的形態學

菌株L-43 在PDA 平板生長7 d 時，單菌落表面不平，表面蓬松，菌絲絲絨狀，菌落中間灰色，外圍白色，無滲出液。主要顯微形態特征菌絲較細，鏈狀，直或彎曲，有分支，分生孢子單生、呈梨形，分隔明顯且無規律。根據菌株L-43 的形態學特征將其鑒定為Alternaria tenuissima（鏈格孢屬）（圖1）。

3.2 小花清風藤葉內生真菌L-43 分子鑒定

內生真菌L-43 經ITS 區經引物V9D 和LS266 擴增、PCR產物測序得到934 bp 的rDNA 序列。將所測內生真菌L-43 的擴增產物序列輸入NCBI 中進行Blast 序列比對分析，篩選出與內生真菌L-43 種屬最相似的序列，并用MEGA5.05 軟件構建系統進化樹，結果顯示，在進化樹中，內生真菌L-43 與Alternaria tenuissima KJ082100 聚類在同一分支（圖2），親緣關系最為接近，結合在GenBank 中登錄結果顯示二者相似度為100%，同時，結合L-43 的形態學特征，最終將菌株L-43 鑒定為Alternaria tenuissima（鏈格孢屬）。

圖2 菌L-43 的ITS 系統進化樹

4 討論

實驗結果發現分子生物學鑒定后為一個種屬的的幾種菌出現了生長形態和顯微形態不同的情況，此種情況該以形態學鑒定為主還是以分子生物學為主。有學者認為，此種情況該一分子生物學鑒定結果來判斷其種屬。內生真菌的形態易受溫度、時間、培養基等培養條件的影響，從而導致其鑒定結果的影響；分子生物學鑒定及反映了內生真菌的分類地位，又反映了其進化水平和與其他生物的親緣關系[10]。

總之，本研究首次從苗藥小花清風藤的葉中分離得到內生真菌L-43，并采用形態學及分子鑒定方法將其鑒定為Alternaria tenuissima（鏈格孢屬）。針對這類內生真菌我們將進行大批量發酵，對其發酵代謝產物進一步篩選其生物活性，以期從其發酵液中獲得有效的生物活性物質。