去甲氧基姜黃素對毒胡蘿卜素誘導乳鼠心肌細胞內質網應激的影響

崔健昆，耿乃志，孟凡吉，施麗春，田耕，韓玉生*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫科大學，黑龍江 哈爾濱 150001)

中藥姜黃，性味辛、苦，溫，可以內行氣血、外散風寒，功能活血散瘀、行氣通經、止痛消腫，長于治療胸痹、痛經、風濕痹痛、跌打腫瘀等。姜黃素和去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin,DMC)是姜黃的主要活性成份，二者具有相近的化學結構和相似的藥理作用。研究發現，姜黃素對心血管損傷具有良好保護作用，臨床主要用于心力衰竭、動脈粥樣硬化、心律失常等疾病的治療[1-3]。作為姜黃素的天然衍生物， DMC對心血管的保護作用及機制的研究尚不十分明確。本研究采用(Thapsigargin，TG)誘導乳鼠心肌細胞建立(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)模型，旨在探討DMC調節GRP78和CHOP蛋白表達水平的影響及意義，為 DMC防治心血管疾病提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生24～48 h的清潔級SD新生鼠由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(黑)2016004。

1.2 藥品與試劑

去甲氧基姜黃素(DMC)、毒胡蘿卜素(TG)購自美國 Sigma 公司；DMEM 培養基、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青公司；LDH、MDA和SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司； CCK-8、細胞凋亡檢測試劑盒，購自Dojindo； GADPH單抗、GRP78和CHOP多克隆抗體購自CST；蛋白質相對分子質量標準，美國 MBI公司；SDS-PAGE電泳凝膠，ECL檢測試劑盒，美國 Amresco公司；PVDF 膜，美國Millipore 公司；其余試劑為國產分析純試劑。

1.3 儀器

酶標儀(Multiscan MK3型)，美國Thermo公司；CO培養箱(BC-J80S型)，上海博迅公司；超凈化工作臺(SW-CJ-2FD型)，蘇州凈化； 熒光倒置顯微鏡 (IX51型)，日本Olympus；電泳儀及轉膜儀(164-5051型)、凝膠成像系統(Gel Doc XR型)、流式細胞儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 乳鼠心肌細胞培養及分組處理

按參考文獻[4]方法，在無菌條件下將出生24～48 h的新生鼠心尖部位的心肌組織，用無菌剪刀剪成1 mm3大小，加入一定比例的0.15%胰蛋白酶在37 ℃水浴下消化，制備成心肌細胞懸液，然后差速離心貼壁。用DMEM培養液(含15%胎牛血清)將細胞濃度調整為3×106個，接種于培養瓶中進行原代培養。

取原代培養心肌細胞，常規培養24 h后更換無胎牛血清的DMEM培養液繼續培養24 h。隨機分為4組:①對照組：細胞不做任何藥物處理，常規培養24 h至實驗結束；②模型組：培養液中加入1 μmol/L TG，常規培養24 h，建立ERS模型；③DMC低濃度組：在培養液中同時加入1 μmol/L TG和10 μmol/L DMC，常規培養24 h； ④DMC高濃度組：在培養液中同時加入1 μmol/L TG和30 μmol/L DMC，常規培養24 h。

無菌避光環境下，將TG、DMC溶于二甲化亞砜(DMSO)中，配置成 1 mol/L的儲存液，分裝于EP 管中置于-20 ℃的冰箱中避光保存。

1.5 CCK-8 法檢測細胞活力

將心肌細胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，培養液體積100 μL，實驗處理結束后加入10 μLCCK-8，并設立沒有細胞的對照孔，放于培養箱培養3 h，酶標儀在450 nm下檢測A值。每組設6個復孔并重復3次。

1.6 細胞LDH、MDA和SOD水平檢測

調整細胞密度為1×106/mL接種于6孔板，每組設置6個復孔。收集細胞制備成勻漿，檢測 LDH、MDA和SOD 水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.7 Western blot檢測GRP78和CHOP蛋白表達

收集細胞后加入 RIPA裂解液在冰上充分裂解，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。調整蛋白濃度后每孔上樣量為30 μg，SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉后，加入一抗、二抗孵育。ECL顯示，凝膠成像系統掃描并分析蛋白表達水平。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用Annexin V-FITC PI雙染法檢測細胞凋亡百分率。常規培養各組細胞并經干預處理后，0.2%胰酶消化處理，離心收集細胞。4 ℃的PBS洗滌后加入200 μL結合緩沖液重懸細胞，并加入 Annexin V 10 μL，流式細胞儀檢測細胞凋亡。FITC檢測：激發光波長488 nm，發射光波長515 nm；PI檢測：發射光波長560 nm。數據用Flow Jo軟件進行細胞凋亡的相對定量分析。

1.9 統計學方法

2 實驗結果

2.1 DMC對TG誘導心肌細胞活力和細胞凋亡的影響

與對照組相比較，模型組的心肌細胞活力表現為明顯下降，細胞凋亡率明顯增加，P<0.05；與模型組相比，DMC給藥組心肌細胞活力均明顯增加，細胞凋亡率明顯減少，P<0.05。結果見表1、圖1。

表1 DMC對TG誘導心肌細胞活力和細胞凋亡的影響

圖1 DMC對TG誘導心肌細胞凋亡的影響

2.2 DMC對TG誘導心肌細胞LDH 、MDA和SOD 水平的影響

與對照組相比，模型組細胞LDH及MDA含量升高，而SOD活力則降低，P<0.05；與模型組比較，不同濃度DMC干預后，LDH及MDA含量顯著降低，SOD活力則顯著升高，P<0.05。結果見表2。

表2 DMC對TG誘導心肌細胞LDH、MDA和SOD水平的影響

2.3 DMC對 TG 誘導心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達的影響

與對照組相比較，模型組心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達升高顯著，P<0.05；與模型組相比較，不同濃度DMC干預后，GRP78和CHOP蛋白表達降低，P<0.05。表明DMC對TG誘導心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表有明顯的抑制作用。結果見表3、圖2。

表3 DMC對TG誘導心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達影響

注：1.對照組；2.ERS模型組；3.DMC低劑量組；4.DMC高劑量組圖2 DMC對TG誘導心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達影響

3 討論

心肌細胞凋亡是缺血性心臟病重要的病理機制之一，通過抑制心肌細胞凋亡能夠改心臟功能，與ERS相關的細胞凋亡途徑是當前研究熱點[5-7]。ERS主要由蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)、活化轉錄因子6(ATF6) 和肌醇酶1(IRE1) 3種內質網跨膜蛋白介導。研究表明ERS發生與Ca2+代謝紊亂密切相關，Ca2+濃度的穩定是調控內質網分子伴侶GRP78非常重要因素[8]。在ERS發生狀態下，GRP78的表達量呈現明顯增加，可以促使細胞內質網中未折疊的蛋白發生折疊，以此減輕內質網應激的嚴重程度[9-10]。在細胞處于長時間或者嚴重的ERS的情況下，會進一步使內質網中促凋亡蛋白CHOP的表達呈現上調，由抑制凋亡轉變為促進細胞凋亡，最終引起細胞死亡[11-12]。CHOP介導的ERS相關凋亡參與了多種心血管疾病的發生發展[13-14]。TG是多種細胞培養中常用的ERS模型誘導劑[9-10]，通過抑制鈣泵和Mg2+-ATPase，使Ca2+大量轉運到細胞漿中，而內質網中的Ca2+濃度下降，引起內質網功能障礙，未折疊蛋白的含量增加并大量聚集，最終導致ERS的發生[15-16]。

我們前期研究發現，DMC能夠減輕乳鼠心肌細胞缺氧/復氧所造成的細胞損害，對心肌缺血再灌注模型小鼠心肌具有明顯的保護作用，其機制與抑制細胞凋亡和自噬相關蛋白有關。本研究以TG誘導乳鼠心肌細胞ERS為研究對象，探討DMC是否能夠直接抑制ERS的發生及機制。通過預試驗確定1 μmol/L的TG直接刺激細胞24 h為ERS的最佳劑量和作用時間。研究結果表明，與對照組相比較，模型組細胞的活性明顯下降，細胞凋亡明顯增加，LDH及MDA含量升高，而SOD活力則降低，GRP78和CHOP蛋白表達顯著升高；與模型組比較，DMC濃度為10 μmol/L和30 μmol/L分別作用心肌細胞ERS模型24 h時，細胞活性升高，細胞凋亡明顯減少，LDH及MDA含量顯著降低，SOD活力則顯著升高，并且GRP78和CHOP蛋白表達降低。

綜上所述，TG誘導了心肌細胞發生ERS，GRP78、CHOP蛋白表達增加，促進了心肌細胞凋亡， DMC能夠劑量依賴性的抑制GRP78和CHOP蛋白的高表達，使PERK活化和磷酸化水平受到明顯抑制，減弱ERS時內質網中蛋白質的積聚，同時降低LDH和MDA的釋放、提升SOD酶活性，從而保護心肌細胞免于ERS損傷，可能為DMC治療心血管疾病提供新靶點。