芪黃補腎泄濁方對腎小球系膜細胞Nrf2/HO-1信號通路的影響

金麗霞,金麗軍,欒仲秋,潘超,馬艷春*

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江牡丹江市腫瘤醫院頭頸乳腺一科，黑龍江 牡丹江 157000; 3.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病臨床常見而且相對比較嚴重的微血管并發癥，也是慢性腎衰竭的常見病因[1]。DN病理多主要表現為系膜細胞不同程度的增生、腎小球硬化伴有不同程度的腎間質纖維化[2]。糖尿病腎病的發病機制是多方面相互作用的復雜結果，主要機制局部RAAS系統激活、糖代謝紊亂、晚期糖基化產物、異常細胞因子、氧化應激反應、遺傳因素等[3]。但是確切的機制還需要進一步研究。高血糖可介導相關信號通路活化，進而加重氧化應激反應，大多數學者認為該機制在糖尿病引起腎臟損傷加重和發展中起到重要作用。既往研究表明[4]，Nrf2/ARE通路是重要的內源性抗氧化應激通路，其中核因子紅細胞衍生2相關因子/血紅素氧合酶(Nrf2/HO-1)是細胞內抗氧化應激非常重要的通路之一。對于糖尿病腎病的進展起重要作用[5]。

芪黃補腎泄濁方主要由黃芪、酒蒸大黃、蒲公英、貓須草、積雪草、丹參、生牡蠣、淫羊藿、菟絲子等藥物組成，是在多年臨床實踐中不斷總結的經驗方，一直應用于臨床，是治療糖尿病腎病的有效方劑，療效確切。芪黃補腎泄濁方治療糖尿病腎病的臨床應用顯示芪黃補腎泄濁方能顯著改善糖尿病腎病患者的臨床癥狀、體征及相關實驗室指標，且無任何毒副作用。既往系統的實驗研究也進一步驗證了芪黃補腎泄濁方抗腎小球硬化和延緩糖尿病腎病進展的作用機制，這無疑給更多的臨床糖尿病腎病患者帶來防病治病的希望，將極大的減輕社會和患者家庭的沉重負擔。該項目的開發和應用，將進一步為臨床治療提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康的Wistar大鼠60只，雄性，購自黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心，動物許可證號：SYXK(黑)2013-011。實驗細胞：人腎小球系膜細胞購自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 實驗藥物

芪黃補腎泄濁方主要由黃芪、酒蒸大黃、蒲公英、貓須草、積雪草、丹參、生牡蠣、淫羊藿、菟絲子等藥物組成，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室制備。

1.3 主要實驗儀器和試劑

儀器：電熱恒溫培養箱，型號DH36001B，天津泰斯特公司。超純水系統，型號NW10LVF，中國Heal Force公司。顯微鏡及拍照系統分別為型號BX53及DP73，均購自日本OLUMPUS公司。試劑：HO-1購自Wanleibio公司，產地中國，貨號WL02400。Nrf2 購自Wanleibio公司，產地中國，貨號WL02135。生物素標記山羊抗兔IgG購自Beyotime公司，產地中國，貨號A0277。辣根酶標記鏈酶親合素購自Beyotime公司，產地中國，貨號A0303。TritonX-100購自Beyotime公司，產地中國，貨號ST975。DAB顯色液購自Solarbio公司，產地中國，貨號DA1010。

1.4 主要配制試劑及其配制方法

0.1%TritonX-100：1 μLTriton×100溶于1 mLPBS中，充分混勻。0.1 M PBS：將29 g Na2HPO4與3 g NaH2PO4及85 g NaCl充分在 500 mL蒸餾水中溶解，并1 000 mL定容。0.01 M PBS：上述0.1 M PBS 100 mL與900 mL蒸餾水充分融合，再加入0.5 mL Tween-20混合后，用NaOH將酸堿度調節至pH7.2～7.4。

蘇木素：將0.4 g蘇木精加入50 mL無水乙醇中溶解備用，2 g硫酸鋁加入150 mL蒸餾水溶解，將配置兩者的溶液混勻，加熱沸騰后加入0.1 g碘酸鈉和0.2 g檸檬酸，冷卻至室溫。

2 實驗方法及步驟

2.1 HMC的培養和傳代

將HMC細胞株復蘇后，將細胞懸液以5×105個/mL接種于培養瓶中，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養箱培養，每1～3 d換液1次，細胞生長至融合狀態，即可傳代。本實驗選用3～10代的細胞。

2.2 芪黃補腎泄濁方含藥血清的制備

將Wistar大鼠60只適應性喂養1周后，隨機分為5組，即正常對照組、高糖組、芪黃補腎泄濁低、中、高劑量組，芪黃補腎泄濁低劑量組按0.243 g/(kg·d)、芪黃補腎泄濁中劑量組按0.486 g/(kg·d)、芪黃補腎泄濁高劑量組按0.972 g/(kg·d)的芪黃補腎泄濁方灌胃給藥，正常對照組及高糖組均給予與芪黃補腎泄濁方同等劑量的生理鹽水灌胃，各組大鼠灌胃每日1次，連續灌胃給藥1周。在末次灌胃后2 h麻醉，無菌操作腹主動脈采血，3 000 rpm×15 min離心后取血清，56 ℃水浴滅活補體30 min，經0.22 μm孔徑的針頭濾器過濾除菌，分裝后-20 ℃冰箱凍存備用。

2.3 實驗分組及藥物處理

實驗分5組，即正常對照組(A組)、高糖組(B組)、芪黃補腎低(C組)、中(D組)、高劑量組(E組)。A組HMC給予正常大鼠血清的培養液(血清濃度10%)培養，B組HMC予含正常大鼠血清的高糖培養液(血清濃度10%)培養，C組予含芪黃補腎泄濁方低劑量含藥血清的高糖培養液(血清濃度10%)培養干預，D組予含10%芪黃補腎泄濁方中劑量含藥血清的高糖培養液(血清濃度10%)培養干預，E組予含10%芪黃補腎泄濁方高劑量含藥血清的高糖培養液(血清濃度10%)培養干預。

2.4 免疫細胞化學法檢測Nrf2和HO-1的表達

0.1%TritonX-100孵育，3%過氧化氫孵育，血清封閉，一抗孵育，二抗孵育，辣根酶標記，DAB顯色，蘇木素復染，鏡檢。

2.5 Western blot測定各組系膜細胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達

蛋白質的抽提：首先在室溫下融化本實驗所需要的裂解液，把裂解液按實驗所需分裝，分裝后加入體積1%的PMSF混合后留置備用。根據實驗不同指標樣本加入適當體積的裂解樣本，在冰上靜置5 min。4 ℃條件下，用低溫冷凍離心12 000 rpm×10 min，分離上清即為所需的蛋白質抽提物。

蛋白質定量：將待測樣本蛋白抽提物與PBS緩沖液按1∶19混勻制備成蛋白質待測液。BCA反應：將A液：B液體積比50∶1配制好，加入各孔中，充分混勻后，放于37 ℃環境下反應20 min，溶液由綠色變為紫色。數據讀取：設定酶標儀讀取波長為570 nm，記錄吸光OD值(A)。

2.6 Real-time PCR定量分析HO-1mRNA表達

各組細胞樣本提取總RNA后，使用紫外分光光度計NANO 2000測定各樣本中RNA的濃度。反轉錄：將上述所得到的RNA樣本進行反轉錄以得到對應的cDNA。實時熒光定量分析,引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 Nrf2、HO-1的表達結果

各組細胞培養48 h末免疫細胞化學法檢測Nrf2、HO-1的表達結果比較，與A組比較，B組細胞內Nrf2、HO-1的表達較A組減少，與B組比較，C組、D組及E組細胞內Nrf2、HO-1的表達增多，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見圖1、2。

圖1 各組細胞培養48 h末免疫細胞化學法檢測Nrf2表達結果

圖2 各組細胞培養48 h末免疫細胞化學法檢測HO-1表達結果

3.2 Western blot測定各組系膜細胞中Nrf2、HO-1蛋白的表達

各組細胞培養48 h末Western blot測定各組系膜細胞中Nrf2、HO-1蛋白的表達結果比較，與A組比較，B組細胞內Nrf2、HO-1的表達減少，與B組比較，C組、D組及E組細胞內Nrf2、HO-1的表達增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表2，圖3、4。

表2 Western blot測定各組細胞中Nrf2、HO-1蛋白的表達

圖3 Western blot測定各組細胞培養48 h末Nrf2及HO-1蛋白的表達

注：與A組比較,#P<0.05;與B組比較,*P<0.05圖4 Western blot測定各組細胞培養48 h末Nrf2及HO-1蛋白的表達

3.3 Real-time PCR定量分析HO-1mRNA表達

本研究分析方法利用2-△△CT方法。本實驗每種樣本每個基因平行實驗進行4個復孔，利用2-△△CT方法分析數據,見表3，圖5。

表3 各組HMC48 h末HO-1表達相對值比較

注：與A組比較,# P<0.05;與B組比較,*P<0.05圖5 各組細胞培養48 h末 HO-1mRNA表達

Real-time PCR結果顯示，各組細胞HO-1mRNA在正常對照組可有少量表達，高糖刺激48 h后高糖組較對照組表達減少，不同劑量芪黃補腎泄濁方藥物血清刺激后表達增加，且以中劑量組和高劑量組表達增加更明顯，芪黃補腎泄濁方可通過上調高糖刺激下HMC中HO-1mRNA的表達，延緩DN的進展。

4 討論

DN為一種較為常見的糖尿病慢性微血管并發癥[6]，是引起終末期腎臟病的重要原因，一些西方國家如歐美、日本等的統計資料顯示，DN已經成為引起慢性腎衰竭的第一位病因[7]。我們國家DN 的發病率也在不斷升高。由于DN臨床癥狀不典型，容易不被引起注意，且病情發展迅速，往往確診時已處于不可逆階段，并很快進展到終末期腎臟病。目前臨床上對DN治療效果不理想，尚沒有特效的治療手段。預后仍然是目前臨床醫生亟待解決的難題。如何提高臨床早期診斷率，早期采取積極有效的治療，延緩或逆轉糖尿病引起腎臟損傷是很多科研人員和一線醫生共同面對的重要課題。

雖然糖尿病進展至腎臟損傷的發病機理還不是很清楚，但是越來越多的實驗結果表明體內高血糖以及由此產生的氧化應激與糖尿病腎臟損害有著密切的關聯。氧化應激是各種有害因素損傷機體后，氧化應激系統之間失衡，導致細胞或組織的病理性損害。DN是DM主要的微血管并發癥，氧化應激在 DN的發病中起到關鍵作用。體內持續存在的高血糖狀態會產生大量的 ROS， ROS腎實質細胞中的蓄積可進一步引起腎臟內基質重構、組織纖維化，促進 DN 的發展[8]。Nrf2/HO-1信號通路是細胞內抗氧化應激最重要的通路之一，因此，調控Nrf2/HO-1信號通路有可能成為防治DN的新靶點。

Nrf2是Nrf2/HO-1信號通路的關鍵因子之一，也是其中樞調節者，Nrf2是近年來新發現的核轉錄因子，其具有堿性亮氨酸拉鏈結構，能夠識別ARE元件并與其結合，進而轉錄表達一系列抗氧化應激酶類或二相解毒酶，起到保護氧化應激引起的器官損傷。Nrf2是調節細胞內抗氧化物表達的關鍵蛋白因子，對細胞內氧化與抗氧化平衡起著重要的調節作用，具有抑制細胞凋亡、神經保護和抗炎癥反應等作用[9-10]。Nrf2作為一種轉錄因子，可以對各種抗氧化酶和II期解毒酶的不同基因進行激活編碼，從而達到抗氧化應激和清除ROS的作用[11]。生理情況下，Nrf2是結合其抑制劑Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)，保留在細胞質中[12]無轉錄活性。當受到相關因素刺激的情況下，Nrf2會從Keap1解離，導致Nrf2入核，引起抗氧化反應元件(ARE)轉錄活化調節基因，其中包含血紅素加氧酶1(HO-1)[13]。HO-1是由其調節的下游非常重要的酶，形成Nrf2/HO-1途徑。HO-1可以降解血紅素，是一種應激誘導型和氧化還原敏感性蛋白，從而有間接抗氧化的作用[14]。

Nrf2作為一種重要的轉錄因子，可以減輕氧化應激引起的器官損傷，在外界因素引起機體氧化應激損傷時，可以誘導啟動細胞保護基因的表達，激活Nrf2能夠緩解腎臟纖維化、腎缺血再灌注損傷等，是一個強有力的轉錄激活劑。HO-1也是機體內對氧化應激損傷起重要保護作用的一種抗氧化物酶蛋白，抗氧化能力非常強大。既往相關研究已表明在炎癥級聯反應中NF-κB是一個非常重要的調控因素， Nrf2/HO-1 通路與 NF-κB通路又存在著密切的關聯，Soares等[15]相關研究表明HO-1是Nrf2信號通路與NF-κB信號通路樞紐因子，通過激活Nrf2通路可以上調HO-1的表達，能減輕機體的炎癥反應。研究結果也表明Nrf2/HO-1通路在體內承擔著重要的調節抗氧化應激反應的功能，轉位進入細胞核的被激活的Nrf2，與ARE作用后上調HO-1抗氧化酶表達水平及活性，發揮抗氧化作用[16]。

本研究結果中免疫細胞化學及Western blot結果顯示，正常大鼠血清的培養液培養的人腎小球系膜細胞可以少量表達Nrf2 及 HO-1，加入高糖刺激后Nrf2 及 HO-1表達減少，加入不同劑量的芪黃補腎泄濁方藥物血清后，Nrf2 及 HO-1表達增加，通過Real Time PCR進行檢測，結果顯示芪黃補腎泄濁方可升高HO-1mRNA的表達，活化Nrf2/HO-1通路發揮抗氧化應激的作用。

綜上所述，氧化應激反應在DN發生發展中起重要作用，芪黃補腎泄濁方可增加高糖培養下人腎小球系膜細胞Nrf2及 HO-1的表達。我們推測芪黃補腎泄濁方可通過調節 Nrf2/HO-1信號通路減輕氧化應激反應，從而緩解DN,為芪黃補腎泄濁方進一步臨床應用提供實驗依據。