宮頸癌組織中miR-365、miR-135a-5p及STAT3的表達水平及意義

王亦如，杜二球

(1.浙江省溫嶺市中醫院病理科，浙江 溫嶺 317500；2.臺州市中心醫院婦產科，浙江 臺州 318000)

宮頸癌危害女性生殖健康的生殖道腫瘤之一，目前雖可通過篩查技術早發現，但其仍未得到很好控制，且發病率呈現年輕化趨勢[1]。因此，探討宮頸癌的發病機制對預防宮頸癌有重要意義。微小蛋白核糖核苷酸(miRNA)是一種長度較短的單鏈RNA，它能夠通過結合miRNA的3′-端非編碼區來調節靶基因的表達。miRNA在腫瘤細胞的生物學過程中發揮著重要作用，如調節腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和侵襲等[2]，故分析不同miRNA在宮頸癌中的作用可為宮頸癌防治提供更多信息。研究顯示宮頸癌中微小蛋白核糖核苷酸(microRNA，miR)-135a-5p的表達上調可影響信號轉導與轉錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)3、GATA結合蛋白3，進而參與宮頸癌的發生發展[3]。部分研究顯示，miR-365作為抑癌基因，其過表達能減弱癌細胞的遷移和侵襲[4]，但其在宮頸癌中的研究較少。本研究探討宮頸癌癌組織中miR-365、miR-135a-5p及STAT3的表達水平，以驗證相關研究結論，并為宮頸癌診治尋找新的切入點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集浙江省溫嶺市中醫院2016年1月至2019年6月間收治的132例宮頸手術切除標本。納入標準：①所有組織標本均病理診斷明確；②術前未接受放化療、免疫治療等任何抗癌治療；③臨床資料完整。排除標準：①研究對象合并其他惡性腫瘤者；②入組前接受其他宮頸治療者。132例組織標本中宮頸癌75例(宮頸癌組)、宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)30例(CIN組)、正常宮頸組織27例(對照組)。宮頸癌組：年齡33～65歲、平均年齡(48.37±8.04)歲。CIN組年齡30～62歲、平均年齡(47.47±8.96)歲。對照組年齡30～65歲、平均年齡(48.73±8.56)歲。三組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 檢測方法

1.2.1實時熒光定量聚合酶鏈式反應

取凍存的宮頸組織標本，溶解后使用Trizol試劑(Trizol RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司)從組織中提取總RNA，經紫外分光光度計測定RNA純度與濃度，根據OD260/OD280比值估計，將符合濃度標準的RNA分裝標記，-80℃保存；使用miRNA逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄成cDNA(miRNA逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司)，按照試劑盒說明配置聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)體系，使用實時PCR儀進行實時PCR(PCR試劑盒購自上海妍琦生物科技有限公司，實時PCR儀為美國ABI 7500型)。PCR擴增反應條件：95℃預變性2min、95℃變性10s、55℃退火30s，變性、退火39次。每個樣品設置三次重復孔。miR-365、miR-135a-5p的引物由上海生工生物有限公司合成，均以U6作為內參反應體系，使用2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量。

1.2.2免疫組化SP法

取4%多聚甲醛固定的宮頸組織塊，常規石蠟包埋、4μm切片，石蠟切片置于烤箱中烤干，然后置入二甲苯中脫蠟、梯度酒精脫水，PBS 5min×2次清洗后在切片上滴加3%過氧化氫溶液去內源性過氧化物酶，PBS 5min×3次清洗，甩干后使用pH 6.0枸櫞酸緩沖液進行抗原修復，PBS 5min×3次清洗，滴加血清工作液封閉10min后清干，滴加一抗(STAT3單克隆抗體，上海晶抗生物工程公司提供)，4℃冰箱孵育過夜后加入二抗，二氨基聯苯顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、干燥后封片，光學顯微鏡下隨機抽取10個高倍鏡視野觀察細胞染色情況。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 評估標準

STAT3以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性，染色強度分為無著色、淺黃色、棕黃色和棕褐色，分別計分0～3分；陽性細胞數分為無陽性細胞、<10%、11%～50%、51%～75%、>75%，分別計分0～4分；總分=染色強度×陽性細胞占比得分，0～2分為陰性，≥3分為陽性[5]。

1.4 觀察指標

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測各組miR-365、miR-135a-5p表達水平，采用免疫組化SP法檢測各組STAT3表達水平，分析miR-365、miR-135a-5p及STAT3表達水平與宮頸癌臨床病理特征間的關系。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組間miR-365、miR-135a-5p、STAT3表達水平

三組間miR-365相對表達量、miR-135a-5p相對表達量比較差異均具有統計學意義(均P<0.05)，進一步每兩組間比較發現宮頸癌組miR-365相對表達量均顯著低于CIN組和對照組(t值分別為2.788、3.457，均P<0.05)，而miR-135a-5p相對表達量均顯著高于CIN組和對照組(t值分別為2.994、3.906，均P<0.05)。CIN組miR-365相對表達量顯著低于對照組(t=2.753，P<0.05)，而miR-135a-5p相對表達量顯著高于對照組(t=2.805，P<0.05)。此外，三組間宮頸組織中STAT3陽性率比較差異具有統計學意義(P<0.01)，進一步每兩組間比較結果發現宮頸癌組織STAT3陽性率均顯著高于CIN組和對照組(χ2值分別為10.647、71.889，均P<0.01)，而CIN組宮頸組織STAT3陽性率顯著高于對照組(χ2=24.211，P<0.01)，見表2。

表2 各組間miR-365、miR-135a-5p、STAT3表達水平比較

2.2 各指標診斷宮頸癌的ROC曲線

ROC曲線顯示miR-135a-5p、miR-365及STAT3診斷宮頸癌的AUC分別為0.862、0.747、0.644(均P<0.05)，STAT3敏感性最高，miR-365特異性最高，見表3及圖1。

圖1 各指標診斷宮頸癌的ROC曲線

2.3 miR-365、miR-135a-5p、STAT3與宮頸癌臨床病理特征的關系

腫瘤直徑≤5cm、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、有淋巴結轉移者宮頸組織miR-365相對表達量較低(均P<0.05)，而miR-135a-5p相對表達量較高(均P<0.05)，差異均具有統計學意義。不同年齡、病理類型、分化程度、宮旁浸潤患者miR-365、miR-135a-5p及STAT3表達水平比較差異均無統計學意義(均P>0.05)，不同腫瘤大小、FIGO分期及有無淋巴結轉移患者STAT3比較差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表4。

表3 各指標診斷宮頸癌的效能

表4 miR-365、miR-135a-5p、STAT3與宮頸癌臨床病理特征的關系

3 討論

3.1 miR-365、miR-135a-5p及STAT3與宮頸癌發生的關系

宮頸癌的發生主要與高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HPV)感染相關，少數患者經CIN最終發展為宮頸癌[6]。由CIN轉變到宮頸癌的過程可長達十數年，這一轉歸是多因素、多步驟的過程。miRNA作為腫瘤生物學中的核心分子，其對基因表達的轉錄后調控已被證實是與多種生理、病理過程相關的關鍵調節方式[7]。因此，探討miRNAs在宮頸癌發生機制中作用，對篩選高危人群和早期防治有明顯積極意義。miR-135a-5p屬于miR-135家族成員之一，有研究顯示miR-135a-5p在宮頸癌組織中高表達，還可影響STAT、GTAT蛋白表達[8]，miR-135a-5p可能在促進宮頸癌發展中起重要作用。而STAT3與HPV感染、CIN進展均關系密切，還參與調節惡性腫瘤細胞周期、增殖與凋亡。除致癌基因外，抑癌基因負反饋減弱也是惡性腫瘤發生的重要機制之一。Chen等[9]學者的研究顯示，miR-365過表達在體內外均顯著抑制膽管癌生長，并促進癌細胞凋亡。故本研究探討促癌基因miR-135a-5p和STAT3，抑癌基因miR-365在宮頸癌患者中的影響及其臨床意義。

3.2 miR-365、miR-135a-5p及STAT3異常表達在宮頸癌發生中的作用

miR-135a-5p屬于miR-135家族，有文獻指出，miR-135a是調控腫瘤細胞侵襲抑制因子表達的重要基因，且會影響宮頸癌細胞的糖酵解和上皮-間充質轉化[10]。本研究結果顯示，miR-135a-5p在宮頸癌患者和CIN患者中相對表達量升高(P<0.05)，且宮頸癌患者miR-135a-5p相對表達量顯著高于CIN組(P<0.05)，反映出miR-135a-5p可能參與宮頸癌形成。STAT3表達水平也表現出相近趨勢，宮頸癌組STAT3陽性率明顯高于其他兩組(P<0.05)，與張少娟等[8]學者的研究結論相近。有研究顯示丙肝病毒能通過增加miR-135a-5p表達，抑制其靶基因表達，間接促進STAT3表達[11]，這也說明STAT3與miR-135a-5p間存在相關性。而STAT3在高危型HPV感染者中表達增高，且高危HPV感染者可激活白介素-6/STAT3通路，通過腫瘤微環境中自分泌或旁分泌信號誘導腫瘤相關成纖維細胞的衰老，促進宮頸癌的發生發展。STAT3通路還在細胞周期調控和凋亡中起作用，機體正常狀態下其激活相對快速且短暫，從而維持正常細胞生理功能，但其表達異常可持續性激活，經多種途徑導致細胞異常增殖及惡性轉化[12]。因此，miR-135a-5p過表達，可通過解除其靶分子對STAT3的抑制，來調控STAT3及其信號通路，參與宮頸癌發病過程。本研究通過繪制ROC曲線發現，miR-135a-5p診斷宮頸癌發病的AUC可達85%以上，STAT3診斷AUC也在60%以上，但STAT3診斷特異性略低，推測是由于部分CIN患者也表現出STAT陽性。但miR-135a-5p診斷宮頸癌發病敏感性可達90%以上，特異性也在65%以上，能較好地鑒別良惡性宮頸病變，最佳臨界值為5.03。在宮頸癌病情進展中，miR-135a-5p也發揮一定作用。本研究結果顯示，5cm腫瘤者、Ⅲ-Ⅳ期腫瘤者、有淋巴結轉移者miR-135a-5p表達水平均更高(P<0.05)。

本組數據中，miR-365相對表達量在宮頸癌患者中顯著下調。郭穎等[13]學者確定E74樣受體4是miR-365在宮頸癌中的靶分子，miR-365表達下調，解除對其的抑制作用，從而促進宮頸癌細胞的增殖和腫瘤形成。MiR-365診斷宮頸癌發病AUC為0.747，其診斷敏感性和特異性均在70%以上，是實用性較高的一個診斷指標，最佳臨界值0.94。在生物信息學預測和實驗驗證中，miR-365通過靶向抑制細胞周期蛋白和B淋巴細胞瘤-2來發揮作用，miR-365下調會影響正常細胞周期進程，促進惡性轉變。同時，本研究也發現，miR-365在腫瘤直徑更大者、中晚期腫瘤及有淋巴結轉移者中表達水平更低(P<0.05)，說明下調miR-365也參與宮頸癌病情進展。由于本研究缺乏隨訪資料，因此未能評估miR-135a-5p、miR-365、STAT3與宮頸癌預后的關系，有待進一步研究。

綜上所述，宮頸癌癌組織中miR-365下調、miR-135a-5p上調，STAT3表達水平高于正常組織，miR-365、miR-135a-5p均與宮頸癌患者腫瘤大小、臨床分期和淋巴結轉移相關，miR-365、miR-135a-5p及STAT3是診斷宮頸癌的有效指標。