兩種檢測HBV RNA方法在核苷(酸)類似物經治和初治慢性乙型肝炎患者中的相關性和一致性評價

王雪剛 張新枝 楊澍 甘蘇琴 劉詩 郝坤艷 周彬 于樂成

近年來，隨著乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)抗病毒藥物，主要是核苷(酸)類似物(Nucleoside/nucleotide Analogues, NAs)的廣泛使用，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的病毒復制及肝臟炎癥均得到了很好的控制[1-2]。在丙氨酸氨基轉移酶(ALT)等肝生化指標持續正常、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)下降不明顯、HBV DNA和HBeAg檢測不出的情況下，如何更精準地監測患者病毒復制情況和選擇合理的停藥時機，是目前臨床實踐中常見的問題[3]。隨著這些新問題的提出，HBV RNA作為新的可能反映肝細胞內HBV cccDNA水平的血清學指標，近年來迅速成為臨床和相關基礎研究人員關注的一個熱點。

HBV是一種DNA病毒，近年來一直以血清HBV DNA水平作為反映患者病毒復制水平的指標。血清HBV RNA的檢測早在1994年就有文獻報道，研究者利用PCR和RT-PCR可以同時從HBV相關肝癌和CHB患者血清檢測到HBV DNA和HBV RNA[4-5]。由于當時對HBV RNA臨床意義的認知不如HBV DNA和HBsAg明確，所以在相當長的時間里未得到臨床醫生和科研工作者應有的重視。2015年以來，研究者們發現在HBV DNA獲得持續抑制的患者中，仍然能檢測到血清HBV RNA，其存在的意義和價值立即引起了臨床醫生和研究者的極大興趣[6-8]。

隨著對血清HBV RNA臨床應用的關注，許多檢測HBV RNA的方法和試劑盒也應運而生。我們對比了文獻報道中常用的“互補DNA末端快速擴增法”(rapid amplication of complimentary DNA-ends，RACE)和一種Sansure國產試劑盒檢測CHB患者血清HBV RNA的效能，采樣兩種方法對治療和未治療患者血清中的HBV RNA水平檢測值進行了評價，以期探討不同檢測方法在臨床應用中的一致性和可替代性。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年6—9月在南方醫科大學南方醫院肝病門診就診的CHB患者，排除接受干擾素、合并丙型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒等其他病毒感染的患者。共納入101例，其中未接受NAs治療患者39例，曾經或正在接受NAs治療者62例，均為參加常規隨訪的患者。所有患者均已簽署知情同意書，項目經南方醫科大學南方醫院倫理委員會批準。

二、HBV DNA及HBsAg等血清學指標的檢測

三、血清HBV RNA檢測

第二種方法采用圣湘公司HBV RNA定量試劑盒(科研用HBV RNA PCR-熒光探針法定量檢測試劑盒，Sansure法試劑盒)，在公司技術人員指導下，完全按照試劑盒說明的步驟操作。通過逆轉錄 HBV 核酸中的 pgRNA(經 DNA 酶消化)，利用針對 HBV pgRNA 序列設計的一組特異性引物與熒光探針，配以 PCR 反應液，應用一步法逆轉錄實時熒光定量 PCR 檢測技術，通過熒光信號的變化實現 HBV pgRNA 的定量檢測。PCR 檢測體系含有陽性內對照(內標)和四個定量參考品，通過檢測內標基因來監測提取核酸中是否具有 PCR 抑制物，評價核酸提取的質量，避免 PCR 假陰性。PCR 檢測體系含有內參比熒光 ROX，用于校正加樣誤差和管間差異，便于儀器自動分析報告熒光與內參比熒光ROX的比值。

四、統計學處理

采用Graphpad 8.0軟件進行統計分析及統計繪圖，組間均值比較采用t檢驗；HBV DNA與HBV RNA及兩種HBV RNA檢測結果的相關性采用R值進行計算；兩種方法檢測的HBV RNA 在未治療和治療患者中的一致性用Bland-Altman圖表示；兩種HBV RNA之間的關系采用線性回歸方程表示。

結 果

一、患者一般情況

101例患者的性別、年齡分布、HBeAg陽性的人數，以及ALT、HBsAg、HBV DNA水平的中位數和范圍見表1。

表1 治療組和未治療組患者的一般情況

二、治療組和未治療組的HBsAg水平和HBV DNA水平

兩組患者的HBsAg水平差異有統計學意義(P=0.0023)，未治療組的HBsAg平均值明顯高于治療組(3.382與2.691 lg U/L)。HBV DNA水平在兩組間差異有統計學意義(P<0.001)，未治療組的HBV DNA平均值明顯高于治療組(5.842對1.656 lg IU/mL)。見圖1。

圖1 治療組和未治療組患者HBsAg和HBV DNA水平比較

三、兩種HBV RNA檢測方法的檢測效能

按照Sansure法的試劑說明，其線性范圍為 3×102～1.00×109拷貝/mL，檢測下限(Low level of detection, LOD)為100拷貝/mL. 本實驗室按照文獻建立的RACE法的線性范圍為4×103～4×1010拷貝/mL，LOD為3 890 拷貝/mL。雖然數值顯示RACE法比Sansure法的LOD更高，但是在本研究中檢測相同的臨床樣本，RACE法比Sansure法的檢測值平均高出0.68 lg 拷貝/mL。

四、治療組和未治療組的HBV RNA水平

兩組患者的血清HBV RNA水平在治療組和未治療組間差異有統計學意義，但差異不如HBV DNA水平的組間差異顯著(P=0.0134)。兩種方法相比，RACE法比Sansure法檢測到的陽性患者更多，分別在101例患者中檢測出60和56例。RACE法比Sansure法的檢出平均檢值更高，分別為3.16 lg 拷貝/mL和2.53 lg 拷貝/mL。治療組中RACE和Sansure的HBV RNA平均值分別為2.259 lg 拷貝/mL和1.650 lg 拷貝/mL(P=0.153 2)；未治療組中RACE和Sansure的HBV RNA平均值分別為4.583 lg 拷貝/mL和3.878 lg 拷貝/mL(P=0.308 6)。兩種方法檢測值的差異無統計學意義(圖2)。

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圖2 治療組和未治療組患者HBV RNA水平比較

五、治療組和未治療組患者HBV DNA與HBV RNA水平的相關性

在治療組中血清HBV DNA水平與HBV RNA水平沒有相關性，RACE法R2= 0.440 6，Sansure法R2= 0.508 1(圖3A)。

在未治療組中，兩種方法均顯示血清HBV DNA水平與HBV RNA水平顯著相關，RACE法R2=0.844 8，Sansure法R2= 0.866 7(圖3B)。

將治療組和未治療組混合分析，相關性不佳，RACE法R2= 0.610 0，Sansure法R2= 0.653 0(圖3C)。

RACE法和Sansure法的HBV RNA檢測值具有顯著的相關性。總體上兩種方法檢測值經相關性檢驗為R2=0.8740，具有顯著相關性(圖3D)。

兩種方法在治療和未治療患者中的一致性采用Bland-Altman圖表示(圖4)。以兩種測量結果的差值為縱軸，以測量結果的均數為橫軸，繪制散點圖，用虛線標注出95%一致性界限(95% limits of agreement, 95% LoA)。95% LoA的范圍較窄(兩個目標之間的差值在治療組為-1.789到0.22 lg 拷貝/mL，未治療組為-2.25到0.53 lg 拷貝/mL)。以RACE法為基準，Sansure法的偏差在治療組為-0.78 lg 拷貝/mL，在未治療組為-0.86 lg 拷貝/mL。偏差值均小于2，兩種檢測值的一致性好(圖4)。經deming線性回歸分析，以Race法結果作為X，以Sansure法結果作為Y，兩者的回歸方程為Y=0.9189X-0.3754。

圖3 HBV DNA水平與HBV RNA水平的相關性及兩種HBV RNA檢測值的相關性

圖4 兩種檢測方法HBV RNA水平在治療和未治療患者中的Bland-Altman一致性分析

討 論

HBV在復制過程中會產生5種HBV mRNA，在早期的研究中，研究者們雖然利用RT-PCR檢測到血清中存在HBV RNA，但未進一步探索其具體組成。近年報道血清HBV RNA有3.5 kb pgRNA、截斷的RNA、剪切的RNA等多種存在形式[10-12]。2016年Wang 等利用HBV 特異性引物分別擴增并定量檢測血清總HBV RNA(包括上述5種mRNA)和HBV 3.5 kb mRNA，發現總HBV RNA的量與3.5 kb mRNA的量無明顯差異，因此推斷血清中HBV RNA主要為3.5 kb mRNA，而3.5 kb mRNA包括兩種mRNA，即pre-C mRNA和pgRNA。Wang等進一步設計HBV特異性引物分別擴增pre-C mRNA與pgRNA的總和，結果未檢測到pre-C mRNA擴增產物，因此證實血清HBV RNA主要是3.5 kb pgRNA[7]。2018年，Bai等報道血清中HBV RNA主要是pgRNA或3’端已被降解的pgRNA，長度從3.5 kb到幾百bp之間呈現出異質性，這些RNA主要存在于核心顆粒中，大多數以抗原抗體復合物的形式存在于血清中，少數也存在于完整的病毒顆粒中[13]。

本文應用的RACE法即是只能檢測帶A尾的HBV RNA，由于其第一步逆轉錄時的引物只能靶向A尾，因此只有帶A尾的RNA能被檢測出來。而本文應用的Sansure法則是需要DNA酶消化的一步法RT-qPCR法，該方法的好處是可以同時檢測帶A尾和不帶A尾的RNA；缺點是應用DNA酶消化后，一方面需要質控HBV DNA是否已經被完全消化干凈(試劑盒設計了相關質控對照)，另一方面需考慮DNA酶對HBV RNA也有消耗作用(Sansure試劑盒無相關質控對照)，這會導致HBV RNA的水平被低估。從理論上講，Sansure法能檢測的RNA種類更多，其水平應該更高。但是本研究結果顯示RACE法在未治療和治療患者中的檢測值均高于Sansure法。除了考慮到不同方法的敏感性不同，還需考慮DNA酶對HBV RNA的消耗作用可能影響了Sansure法的檢測水平。

另外，我們也注意到，治療組和未治療組的HBV DNA水平具有顯著差異，而HBV RNA的水平差異沒有HBV DNA顯著，在治療組患者中這種趨勢更加明顯。這種情況的出現主要是由于在接受治療的患者中大多數HBV DNA已經轉陰，但是部分患者HBV RNA仍然是陽性。在62例治療組患者中，HBV DNA陽性患者為21例，Sansure法檢測的陽性患者為26例，RACE法檢測的陽性患者為31例。這使得各組的平均值也有所不同，提示Sansure法的敏感性仍有改進和提升空間。

兩種檢測方法在治療組患者中均比HBV DNA能檢測到更多陽性患者，這主要是由于NAs治療阻斷了HBV RNA的逆轉錄過程，而對從cccDNA到HBV RNA的轉錄過程并沒有影響。由于HBV RNA是cccDNA的直接下游產物，患者從HBV DNA轉陰到HBV RNA轉陰還需要cccDNA的耗竭作為中間過程，我們最近的一項研究闡明了這中間的時間差[15]。在血清HBV DNA與HBV RNA水平的相關性分析中，只在未治療組患者中觀察到了兩者的顯著相關性，而在治療組患者中未觀察到相關性。這也與上述NAs治療阻斷HBV RNA逆轉錄的機制有關。這部分結果也與雅培公司的報道一致[16]。雖然實驗效能評價中LOD數值Sansure法比RACE法更低，但是相同樣本用兩個方法同時檢測的檢測值則是RACE法更高，這主要是由于兩個方法使用的標準品不一致：RACE法采用本實驗室自己合成的標準品，Sansure法采用相應試劑盒提供的標準品，其線性范圍和LOD值并不具有可比性。如果HBV RNA檢測能像HBV DNA的檢測系統一樣，有世界衛生組織(World health organization, WHO)提供的統一的以IU為單位的標準品進行標定，則不同平臺的結果，其線性范圍和LOD之間才具有可比性[17]。

雖然從原理上來說，本研究的兩種方法檢測的是不同種類的HBV RNA，即Sansure法可同時檢測帶A尾和不帶A尾的RNA，而RACE法只能檢測到帶A尾的RNA。但是我們的結果顯示，總體上Sansure法和RACE法的相關性和一致性較好，并可通過線性回歸公式由一個檢測值推算出另一個檢測值。雅培公司建立了一種自動化的、同時靶向X區和C區的HBV RNA檢測方法，其結果用HBV DNA的標準品作為參比時，在治療的患者中HBV RNA的水平比HBV DNA平均高(2.45 ± 1.13)lg[16]。但在我們的結果中，治療組患者中除了HBV DNA陰性的樣本外，Sansure法和RACE法的平均檢測值均低于HBV DNA的檢測值。說明這兩種檢測方法的效能仍需進一步提高。

在未接受NAs治療的患者中，血清HBV DNA水平與HBV RNA水平具有很好的相關性，因此用HBV DNA水平來檢測HBV的復制水平是很可靠的辦法。但是在接受NAs治療的很多患者血清HBV DNA已經低于LOD，這時候血清HBV RNA即成為更有效、更可靠的監測病毒復制和預測臨床療效的標志物。我們已經發現RACE法在較多的研究報道中被應用于預測NAs和干擾素治療應答或者病程進展，具有較好的預測效能。目前尚未見Sansure法應用于臨床的報道。另外，兩種方法均未見應用于NAs停藥復發的預測[6, 8, 18-19]。鑒于目前尚無HBV RNA的標準檢測方法，沒有統一標準品，也沒有批準用于臨床檢測的商業試劑盒，不同方法的臨床應用場景還需進一步探索。因此，較合理的做法是我們在應用HBV RNA水平作為標志物用于病情監測和預測應答之前，首先需要對不同的方法學進行比較和評估，然后再挑選出合適的方法應用于臨床相關研究。