結合計算機仿真與實驗的響應面法優化抗耐藥結核菌藥物利奈唑胺脂質體的處方組成及釋藥特性研究

楊紅月 黃偉

摘 ?要： 利用乙醇注入法制備抗結核藥利奈唑胺的脂質體，并通過響應面法分析得到最佳制備工藝和最優處方。乙醇注入法制備所得的利奈唑胺脂質體，包封率較高，其最佳工藝為膽固醇與卵磷脂的質量比1∶3類脂注入緩沖液的速度1.2 ml/min、超聲時間3 min;包封率82.36%，RSD=1.32%。乙醇注入法制備利奈唑胺脂質體具有較高的包封率以及緩控效果，Box-Behnken 響應面法可以快速全面的選取最佳制備工藝，方便準確。

關鍵詞： 抗結核;利奈唑胺脂質體;乙醇注入法;響應面法;包封率

中圖分類號： TP311.52 ? ?文獻標識碼： A ? ?DOI：10.3969/j.issn.1003-6970.2020.06.040

本文著錄格式：楊紅月，黃偉. 結合計算機仿真與實驗的響應面法優化抗耐藥結核菌藥物利奈唑胺脂質體的處方組成及釋藥特性研究[J]. 軟件，2020，41（06）：196203

【Abstract】： The liposomes of the antituberculous drug linezolid were prepared by ethanol injection， and the best preparation technology and prescription were obtained by response surface analysis. The results showed that the entrapment efficiency of linazolamide liposomes prepared by ethanol injection method was high. The best technology was： the mass ratio of cholesterol to lecithin： the speed of 1：3 lipid injection buffer was 1.2 ml/min， the ultrasound time was 3min; the entrapment efficiency was 82.36%， RSD = 1.32%. The preparation of linezolid liposomes by ethanol injection has high encapsulation efficiency and slow control effect. Box Behnken response surface method can quickly and comprehensively select the best preparation process， convenient and accurate.

【Key words】： Linezolid liposomes; Membrane dispersion method; The encapsulation rate; In vitro release; Response surface methodology

0 ?引言

結核病是一種慢性的由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，結核分枝桿菌可導致全身器官感染患病，但主要為肺內、外結核，由于結核桿菌寄生于肺泡深處，導致很多情況下用藥效果不好，不能徹底殺滅結核桿菌。近年來，利奈唑胺（linezolid）因其較好的抗菌活性和特有的作用機制而備受關注，利奈唑胺具有良好的抗結核分枝桿菌（MTB）的效果，并且對耐藥菌株也顯示出了很強的抗菌活性。目前利奈唑胺劑型多為口服片劑，雖然其具有許多優勢，但其毒副作用也不容小覷，利奈唑胺有較多的輕度不良反應包括胃腸道反應（腹痛、嘔吐等）、頭痛和皮疹等，高發病率的的嚴重不良反應為血小板減少癥等骨髓抑制反應、神經系統的不良反應、心律失常和乳酸中毒癥。脂質體是抗結核藥物的理想載體，可降低包封藥物的毒性，實現病灶部位直接給藥，而且脂質體的結構與細胞相似，二者之間具有相似相溶性可有效實現藥物傳遞，利奈唑胺為時間依賴性藥物與脂質體的緩釋作用相輔相成。因此將利奈唑胺制備成脂質體直接肺部給藥可使藥物直接作用于病變部位，減少原料藥在體內其他組織的循環吸收，從而達到增加靶區血藥濃度，減少給藥劑量的目的。二者的融合將為結核患者帶來福音。本實驗采用溶劑注入法將利奈唑胺制備成載藥脂質體，并考察其最佳制備工藝和處方組成，為其進行肺部霧化吸入直接給藥研究奠定基礎[1-6]。

1 ?儀器和材料

紫外分光光度計（UV-6000PC）鄭州寶京科技有限公司;臺式離心機（TG16-GWZ）成都喬越儀器有限公司;復合轉子離心機（Mnty-7KS）北京佑寧儀器有限公司; 旋轉蒸發儀（QA-205B）濟寧瑞德儀器設備有限公司;醫用無菌注射器（7號）蘇州治宇醫療器材有限公司 ;循環水式多功能真空泵LY-E（II）鄭州紫拓工貿有限公司 ;數顯恒溫水浴鍋（JHH-4A）無錫馬瑞科技有限公司; 數控探頭超聲（SCQ-5211B）常州市超聲儀器有限公司;電子分析天平AUX200SHIMADZU CORPORATION JAPAN;磁力攪拌加熱板（MSH-R-B）上海越眾儀器有限公司;LS13320型激光粒度分析儀（江蘇 榮華儀器制造有限公司）;倒置熒光顯微鏡（U-LH100HG）OLYMPUS CORPORATION;恒溫水浴磁力攪拌器（SHJ-D60）無錫沃鑫儀器制造有限公司。

利奈唑胺（P09572）上海泰坦科技有限公司;磷酸二氫鈉（20170319）南通煜天化學品有限公司;甲醇（20181006）哈爾濱鑫達化工廠;卵磷脂（20180122）陜西澄明科技有限公司膽固醇（20180228）江蘇百得科技有限公司;二氯甲烷（20180315）濟南奧康化工股份有限公司;吐溫80（20180605）昆明遠聯化工有限公司;磷脂膜熒光劑（20190310）SIGMAALDRICH;95%乙醇（20180121）哈爾濱鑫達化工廠。

2 ?方法

2.1 ?處方前研究

2.1.1 ?利奈唑胺原料藥理化性質的考察

理化性質：別名Renazzoli，白色或灰白色粉末，化學式為C16H20FN3O4，分子質量為337.3461，熔點176-178℃，取過量利奈唑胺于10 ml試管中各加入6 ml乙醇、PH為6.7的PBS緩沖液、生理鹽水測定利奈唑胺在不同溶劑中溶解度，DMSO：>20 mg/ml[7-8]。

2.1.2 ?最大吸收波長的確定

稱取定量磷酸二氫鈉用蒸餾水稀釋，用PH試紙測pH值。配制pH=6.7的磷酸鹽緩沖液（PBS）。

稱取25 mlpH為6.7的磷酸鹽緩沖液備用，精密稱取利奈唑胺0.5 mg溶解于緩沖液中，得到濃度為20 ?g/ml的利奈唑胺溶液，在處于200-400 nm的波長范圍內用紫外分光光度計每相隔10 nm測定吸光度，進行曲線繪制，探索最大吸收波長。

精密稱取卵磷脂和膽固醇適量制備空白脂質體，于25 ml容量瓶中，用pH為6.7的PBS定容至25 ml，在處于200-400 nm的波長范圍內用紫外分光光度計每相隔10 nm測定吸光度，繪制曲線，探索最大吸收波長。

2.2 ?方法學考察

2.2.1 ?標準曲線的繪制及線性回歸分析

稱取1mg利奈唑胺，用pH為6.7的PBS溶液充分溶解移至容量瓶中定容至25 ml，得到濃度為40 ?g/ml的備用液。精密移取標準品溶液0.12、0.24、0.48、0.96、1.46、1.96、2.46、2.96 ml于25 ml容量瓶中，對應濃度為1、2、4、8、12、16、20、24 ?g/ml用pH為6.7的緩沖溶液定容至25 mL充分振蕩得到標準液。以pH為6.7的PBS溶液為空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度。以利奈唑胺濃度C（?g/ml）為橫坐標，吸光度A為縱坐標建立標準曲線并進行線性分析。

2.2.2 ?精密度試驗

分別取低、中、高（2、12、24 ?g/ml）三種濃度的線性范圍內利奈唑胺PBS標準溶液，室溫放置，采用紫外分光光度計測定，一天內測定5次，求算日內精密度，每天測定1次，連續采集5天數據，求算每天之間的精密度。

2.2.3 ?回收率試驗

按處方的比例精密稱取脂質體適量于三支容量瓶中，分別加入濃度為2、12、24的利奈唑胺原料藥，加入甲醇溶解定容后，搖勻，在最大吸收波長處測定吸收度。計算平均回收率和RSD。

2.2.4 ?穩定性試驗

取適量利奈唑胺原料藥溶液（濃度12 ?g/ml），室溫下放置0、1、2、4、6、12 h于最大吸收波長處用紫外分光光度計測定吸光度和RSD。

2.2.5 ?利奈唑胺脂質體包封率測定方法的確立

脂質體包封率為被包封在脂質體囊中的藥量占脂質體混懸液中總體藥量的比例，是本文中評價脂質體的重要指標。本實驗采用的分離游離藥物和載藥脂質體的方法為離心法。

包封率測定方法：取兩支相同型號離心管，精密量取等質量的利奈唑胺脂質體，室溫下于2600 r/min離心機下離心30 min，取上清液0.2 ml至25 ml容量瓶中，用pH為6.7的緩沖溶液定容，在最大吸收波長處測定吸光度，代入回歸方程即得C上清;再取兩支同型號試管量取等質量上述同一批的利奈唑胺脂質體，分別加3ml甲醇實現破乳的目的，充分振蕩后轉到離心管中，之后操作與游離藥物量的測定相同，得到C總[9-11]。

計算包封率的公式：包封率=（C總C游離）/C總×100%

其中：C上清是上清液中游離藥物濃度;C總是破乳后利奈唑胺脂質體的藥物濃度。

2.3 ?溶劑（乙醇）注入法制備利奈唑胺脂質體

精密稱取處方考察量卵磷脂和膽固醇和10 mg利奈唑胺原料藥于燒杯中，加入95%乙醇5 ml，吐溫80 0.2 ml，在60℃恒溫水浴下攪拌至充分溶解形成類脂，同時量取pH=6.7的緩沖液（PBS）40 ml置于恒溫50℃水浴磁力攪拌器上預熱，用10 ml注射器抽取上述類脂溶液在考察量范圍內注入50℃PBS溶液中，攪拌水化1 h，之后室溫下旋轉蒸發除去乙醇（也可不旋轉蒸發），取出樣品在考察范圍內進行探頭超聲，超聲后置于40℃恒溫水浴鍋中放置0.5 h即得成品[12-15]。

2.4 ?利奈唑胺脂質體制備工藝及處方因素考察

2.4.1 ?乙醇注入法制備利奈唑胺脂質體單因素工藝考察

2.4.1.1 ?脂質溶液注入PBS緩沖液速度

其他條件不變情況下，以注射速度分別為0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 ml/min來考察利奈唑胺脂質體包封率。

2.4.1.2 ?探頭超聲時間

其他條件不變情況下，以超聲時間為變量，分別以1、3、5、7 min來考察利奈唑胺脂質體包封率。

2.4.1.3 ?水浴溫度

其他條件不變情況下，以水浴溫度為變量，在水浴溫度為20、30、40、50、60℃下進行利奈唑胺脂質體的制備并考察其包封率。

2.4.2 ?利奈唑胺脂質體處方單因素考察—膽固醇與卵磷脂質量比

其他條件不變情況下，以膽固醇與卵磷脂質量比分別為1：2、1：3、1：4、1：5對利奈唑胺脂質體包封率進行考察。該法采用膽固醇質量不變，增加卵磷脂質量來改變二者比值。

2.5 ?Box-Behnken響應面法優化工藝

根據單因素考察結果，采用Box-Behnken 響應面優化工藝，選取上述四種單因素中對包封率影響較明顯且制備所得脂質體包封率最高的三個因素，進行3因素3水平試驗方案如表6所示，以包封率為其響應值，共17次試驗[16]。

2.6 ?驗證試驗

根據響應面法優化分析，得到利奈唑胺脂質體最佳制備工藝，按此工藝制備三批脂質體，測定包封率和RSD，進行處方和工藝的驗證。

2.7 ?利奈唑胺脂質體體外釋放度考察

精密稱取定量利奈唑胺脂質體（含原料藥約為10 mg），裝入煮沸處理的透析袋中，將其兩端扎緊，固定在玻璃棒上，放于盛有200 mlpH為6.7的PSD緩沖液燒杯中。將燒杯放置于37℃，10 r/min恒溫水浴磁力攪拌器上，攪拌處理;同時做相同濃度的利奈唑胺原料藥的體外釋放度試驗。分別于攪拌 ?0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h取定量（3 ml）透析液測定其吸光度并及時補充等量等溫PBS緩沖液。用所測吸光度轉換為濃度，計算累積釋藥率L。

Q=CnV0 + ? L=Q/W×100%

其中：Q為各時間點累積釋藥量;Cn為各時間點測得藥物濃度;V0為釋藥介質總體積;Vi為i時間每次取樣體積;Ci為i時間各取樣點實際藥物濃度;W為脂質體中總藥物量。

2.8 ?脂質體外觀形態觀察

按照最佳制備工藝和處方分別制備兩組利奈唑胺脂質，第一組在藥脂溶解過程中加入5 ?l濃度為0.01 mg/?l NDB-PE進行熒光染色便于觀察載藥脂質體，第二組不做其他操作，取適量上述兩組利奈唑胺脂質體溶液，用緩沖液適當稀釋后在倒置熒光顯微鏡下進行形態及脂質體分布情況觀察。

3 ?結果

3.1 ?測定波長的確定結果

由圖1與圖2可知利奈唑胺的最大吸收波長在289 nm處，而空白脂質體的最大吸收波長則處于232 nm，對于利奈唑胺的吸光度測定基本無干擾，證明利用紫外分光光度計測定數據是合理的。

3.2 ?方法學考察結果

3.2.1 ?標準曲線的繪制和線性分析

如圖3所示得到標準曲線A=0.01C+0.0516，R2=0.9998。線性范圍為1～24 ?g/ml。

3.2.2 ?精密度試驗結果

試驗結果如表1所示，低、中、高三種濃度的日內精密度RSD%小于0.39%，日間精密度RSD%小于0.95%，證明精密度良好。

3.2.3 ?回收率試驗結果

由表2可見，三種濃度的回收率在99.78%左右，RSD小于0.66%，表明脂質體對藥物含量測定無影響。

3.2.4 ?穩定性試驗結果

穩定性試驗結果如表 3所示6個時間點內吸光度無明顯改變，RSD小于0.20%，表明利奈唑胺脂質體的穩定性在24小時內良好。

3.3 ?乙醇注入法制備利奈唑胺脂質體的制備工藝確定及處方因素考察

3.3.1 ?利奈唑胺脂質體單因素工藝考察

3.3.1.1 ?脂質溶液注入PBS緩沖液速度

按照2.4.1.1中條件操作，得到藥物包封率如圖4所示，可知在注射速度為1.2 ml/ml時，脂質體包封率最大。

3.3.1.2 ?探頭超聲時間

按照2.4.1.2中條件進行操作，得到藥物包封率如圖5所示，可知超聲時間在3 min時，脂質體包封率最大。

3.3.1.3 ?水浴溫度

在2.4.1.3條件下，在溫度變量范圍內制備利奈唑胺脂質體，測定包封率如圖6所示，可知水浴溫度在三個工藝因素考察中對利奈唑胺脂質體的包封率影響不顯著，故此因素不作為主要考察因素。

3.3.1.4 ?利奈唑胺脂質體處方單因素考察—膽固醇與卵磷脂質量比

按照2.4.2（1）中條件進行試驗，得到藥物包封率如圖7所示，可知在膽固醇與卵磷脂質量比在1：3時，脂質體包封率最大。

3.4 ?響應面試驗與結果

3.4.1 ?響應面優化

通過單因素考察后確定對脂質體包封率影響較大且包封率為最大值時的三個主要因素，根據Box-Behnken試驗設計原理，采用響應面法優化設計，試驗結果如表4所示。

對試驗結果進行響應面曲面分析，建立二元多次回歸方程進行回歸分析，如表5。

采用Design Expert8.0.8對數據進行回歸分析，得到回歸方程如下：

Y=91.17+1.19A+0.45B+1.14AB–0.21AC–0.55BC–9.40A2–7.24B2–7.60C2

由表5可知，本實驗模型具有高度顯著性（P< 0.0001），失擬度P=0.0835>0.05為不顯著的，表明該模型無失擬因素而且模型中主要考察因素P值均小于0.05，模型決定系數R2=0.9950，R2Adj=0.9886，代表本次試驗的預測值與真實值相差極小，綜上所述，表明該模型擬合度良好。

3.4.2 ?響應曲面分析

響應面曲線圖可直觀反應包封率與試驗因素的相互關系，圖8圖9為膽固醇與卵磷脂的質量比與超聲時間、脂質溶液注入PBS緩沖液的速度與超聲時間、超聲時間與膽固醇與卵磷脂的質量比三組因素對脂質體包封率的響應面圖，圖8中響應面曲面陡峭，跨度大;圖9中三組等高線為類橢圓形，反映出被考察因素之間相互作用顯著并且等高線與軸線的相交點較多表明考察因素對脂質體包封率的影響均較大，通過Design Expert8.0.8軟件優化得出最佳處方工藝為膽固醇與卵磷脂的質量比：1∶3類脂注入緩沖液的速度1.2 ml/min、超聲時間3 min。

3.5 ?驗證試驗結果

按照最佳工藝方法制備脂質體并進行進行包封率測定得到結果如表6所示，三批脂質體的平均包封率為82.36%，RSD為1.32%，表明該方法制備的脂質體質量較好。

3.6 ?利奈唑胺脂質體體外釋藥性考察結果

由圖10可知，利奈唑胺原料藥溶液釋放較快，4 h累計釋放量就達到了99.95%;利奈唑胺脂質體在24 h時，藥物累計釋放度達到93.37%，利奈唑胺仍未釋放完全，體現了脂質體的良好緩釋效果。

3.7 ?最佳工藝下所制脂質體外觀形態觀察及平均粒徑檢測

3.7.1 ?常規脂質體的觀察

本實驗以最佳工藝制得的載藥脂質體混懸液如圖11所示，混懸液呈乳白色，普通光源下通過倒置熒光顯微鏡觀察，可以看出所制備的載藥脂質體數目較多且形貌較為圓整，如圖12所示。

3.7.2 ?NBD-PE熒光染色后脂質體的觀察

為進一步觀測脂質體形貌使用NBD-PE熒光染色劑染色后的利奈唑胺脂質體呈現出黃綠色，如圖13所示。在倒置熒光顯微鏡可以觀察到利奈唑胺脂質體的雙分子層結構，外觀為橢球形，粒徑較均勻，平均粒徑分布在500 nm左右如圖13圖14。

4 ?討論

本實驗采用乙醇注入法配合超聲制備利奈唑胺脂質體，利奈唑胺物化性質良好，包封效果顯著，傳統脂質體制備使用三氯甲烷等有毒有機溶劑，該法乙醇無毒，但乙醇過量會導致脂質體聚集影響包封率;卵磷脂與膽固醇的比例在有效范圍內可保證包封率的良好，但過量后會導致膜不對稱，藥物泄露降低包封率;在制得脂質體后，應嚴格把控其貯存條件冷藏4℃下放置，如在室溫25℃下儲存則會出現不可逆性沉淀，顆粒變大如圖，影響其包封率。在制備過程中發現，藥品加入的順序、超聲時間、是否用微孔濾膜過濾對脂質體的形態影響很大，而且在膽固醇與卵磷脂被乙醇溶解后有少量膽固醇不溶，需加入吐溫80增溶。利奈唑胺原料藥最后加入，其溶解完全且脂質體均與;超聲時間過長，經微孔濾膜過濾，脂質體變成單室且不宜用倒置顯微鏡觀察到。本實驗分離利奈唑胺與脂質體的方法為離心法，該法的選擇不如葡萄糖凝膠柱層析法，但條件有限，便采用方便易行的離心法代替。.影響脂質體制備工藝的因素有很多，如進行單因素實驗，不能進行因素與因素之間的相互影響考察，采用正交試驗，試驗次數將明顯增多，因此采用響應面法進行工藝優化，響應面法既反映了單一自變量與包封率之間的關系，又體現出每個自變量相互間的作用對包封率的影響，使最佳的考察因素不僅僅局限于設計試驗所選擇的幾個點，而是存在于一個由連續的點構成的曲面的極值處，并且僅為一個點。此法比常規的考察方法更精確。并且，響應面法進行的試驗次數相對較少，并且省時易行。在進行體外釋藥度考察時，發現利奈唑胺脂質體前期的釋藥速度較后期快很多，因為前期釋放為未完全包封的藥物即脂質體膜外附著的藥物，后期釋放的則為脂質體中包封的藥物，由此體現出脂質體的緩釋功能[17-20]。

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