馬錢子藥材的HPLC 指紋圖譜研究

楊紅兵，李錦周，楊 佳，蔣代龍，詹志來，石 磊

（1.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065；2.中國中醫科學院道地藥材國家重點實驗室/中藥資源中心，北京 100700）

馬錢子（Strychni semen）為馬錢科植物馬錢（Strychnos nux-vomicaL.）的干燥成熟種子，傳統道地產地為印度，越南、緬甸、泰國等地也有生產［1-5］。馬錢子味苦、性寒，有劇毒，其中馬錢子堿和士的寧為其主要成分和有毒成分，具有通絡止痛、散結消腫等功效。《中國藥典》2020年版一部［6］馬錢子項下有性狀、鑒別（粉末顯微與薄層色譜）、檢查（水分、總灰分、黃曲霉毒素）、含量測定（馬錢子堿、士的寧）等質控項目和指標，沒有特征圖譜。中藥為多組分復雜體系，中藥材的特征圖譜（也稱指紋圖譜）能較為全面地反映中藥所含化學成分的種類與數量，對藥品質量進行整體描述和評價［7-13］。研究和建立中藥材的指紋圖譜已經成為中藥質量控制的發展方向。本研究采用中藥指紋圖譜技術建立藥材馬錢子的HPLC 指紋圖譜，為馬錢子質量控制提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 馬錢子堿、士的寧對照品購自成都普思生物科技股份有限公司，批號分別為CJ18B110、BF12B015。10批馬錢子藥材樣品為印度進口，經作者鑒定，均為馬錢科植物馬錢（Strychnos nux-vomicaL.）的干燥成熟種子（表1）。甲醇、乙腈為色譜純，濃鹽酸、甲酸為分析純，水為重蒸餾水。

表1 馬錢子樣品

1.1.2 儀器 LC20A 型高效液相色譜儀，軟件工作站LabSolutions，檢測器型號SPD-20A（日本島津公司）；HX-30 型超聲波清洗機（武漢恒信世紀科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相高效液相色譜柱。流動相：乙腈-水（0.2%甲酸）溶液。梯度洗脫，洗脫條件見表2，分析時間60 min。檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL。

表2 梯度洗脫條件

1.2.2 對照品溶液的制備［6］精密稱取士的寧對照品6 mg、馬錢子堿對照品5 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取2 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含士的寧0.12 mg、馬錢子堿0.1 mg 的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取馬錢子粉末0.6 g，置于50 mL 錐形瓶中，加甲醇-水-濃鹽酸（50∶50∶1）溶液25 mL，稱重后超聲提取30 min，取出冷卻后再稱重，滴加提取液補足損失的重量，搖勻后靜置，取上層清液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液作供試品。

1.2.4 參照峰的選擇 比較對照品的保留時間和光譜圖，對供試品色譜峰的歸屬進行分析，其中馬錢子堿為馬錢子的主要有效成分之一，出峰時間適中，與相鄰峰分離較好，且峰面積較大，故定為參照峰，以計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

1.2.5 精密度試驗 取同一供試品（S1）溶液，按色譜條件連續進樣5 次，所得色譜圖中各共有峰相對保留時間（RRT）的相對標準偏差（RSD）為0.078%～0.183%，相對峰面積（RA）的RSD為0.309%～2.273%，表明儀器精密度良好。

1.2.6 穩定性試驗 取同一供試品（S1）溶液，按色譜條件分別于0、4、8、12、24 h 進行測定，各共有峰RRT的RSD為0.083%～0.263%，RA的RSD為0.385%～2.556%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

1.2.7 重復性試驗 取同一批藥材（S1）樣品5 份所分別制備的供試品溶液進行檢測，色譜圖中各共有峰RRT 的RSD為0.106%～0.376%，RA 的RSD為0.959%～2.722%，表明方法的重復性良好。

1.2.8 相似度計算 采用國家藥典委員會編制的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A 版計算相似度，并生成馬錢子的對照用指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 HPLC 指紋圖譜相似度

馬錢子堿、士的寧對照品色譜圖見圖1。10 批印度進口馬錢子藥材樣品HPLC 色譜圖比較見圖2，并計算其色譜圖相似度，馬錢子藥材的對照用指紋圖譜見圖3。由圖2 可以看出，馬錢子各樣品間HPLC 色譜圖中峰數、峰形、峰位（保留時間）等基本一致，峰高、峰面積或相對峰面積有所差異。由表3可以看出，樣品間色譜圖相似度以及與對照用指紋圖譜的相似度均大于0.9，說明共有峰的保留時間或相對保留時間較為一致。

圖1 馬錢子堿、士的寧對照品色譜圖（254 nm）

圖2 10 批馬錢子藥材HPLC 色譜圖（254 nm）

表3 10 批馬錢子藥材色譜圖相似度計算結果

圖3 馬錢子對照用指紋圖譜（254 nm）

2.2 指紋圖譜的建立

藥材馬錢子提取物的所有色譜峰在60 min 內全部出現，記錄60 min 色譜圖即可。比較10 批供試品溶液的色譜圖，確定6 個共有峰（特征峰），其中強峰3 個：1 號峰（未知成分）、4 號峰（馬錢子堿）、5 號峰（士的寧）。以4 號峰作為參照峰，計算各共有峰相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RA），分別見表4、表5，結果符合指紋圖譜要求。由表4、表5 可知，馬錢子共有峰（特征峰，6 個）相對保留時間較為一致，RSD為0.207%～0.412%；而相對峰面積有所差異，與圖2、表1 結果一致。

表4 10 批馬錢子藥材指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表5 10 批馬錢子藥材指紋圖譜共有峰的相對峰面積

3 小結與討論

利用HPLC 構建中藥材的標準指紋圖譜，為中藥材的品質鑒定提供了新的有效方法。本研究表明，10 批印度產馬錢子各樣品間HPLC 色譜圖相似度以及與對照用指紋圖譜的相似度均較高。根據國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A 版”生成的對照用指紋圖譜可作為印度產馬錢子的標準指紋圖譜。

不同產地的馬錢子藥材，HPLC 色譜有明顯差異，其中10 批印度產品可以形成對照用指紋圖譜，樣品與對照指紋圖譜之間的相似度大于0.9。其他產地如中國海南、云南等引種栽培的馬錢子，與對照指紋圖譜相似度較低。因此，對于市場上的馬錢子商品，除指紋圖譜以外，尚須利用性狀鑒別、顯微觀察、含量測定等多種手段綜合評判其真偽優劣。