靶向雄激素受體與糖皮質(zhì)激素受體的抗前列腺癌藥物篩選模型的建立和應(yīng)用

吳萌，謝永麗，崔香玲，周金明，岑山

·論著·

靶向雄激素受體與糖皮質(zhì)激素受體的抗前列腺癌藥物篩選模型的建立和應(yīng)用

吳萌，謝永麗，崔香玲，周金明，岑山

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫室（吳萌、謝永麗、崔香玲、岑山）；321004 金華，浙江師范大學(xué)化學(xué)和生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代制藥創(chuàng)新研究中心（周金明）

尋找可以克服由于糖皮質(zhì)激素（GR）高表達(dá)造成的現(xiàn)有抗雄激素治療藥物耐藥問題的化合物分子。

構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)模型評(píng)價(jià)化合物對(duì)雄激素受體（AR）與GR 的轉(zhuǎn)錄活性影響，進(jìn)行基于AR 拮抗劑分子共同特征藥效團(tuán)模型和基于GR 蛋白晶體結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，對(duì)虛擬篩選得到的化合物分子進(jìn)行初步活性評(píng)價(jià)，驗(yàn)證先導(dǎo)物分子的AR 與GR 轉(zhuǎn)錄抑制活性、耐藥性前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制活性。

成功構(gòu)建可用來評(píng)價(jià)化合物對(duì)AR 與GR 轉(zhuǎn)錄活性影響情況的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，通過虛擬篩選與活性檢測(cè)得到了化合物分子G8，G8 可以抑制AR 與GR 雙靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活性，抑制GR 高表達(dá)的恩雜魯胺耐藥細(xì)胞22Rv1 的增殖。

證實(shí)了通過理性藥物設(shè)計(jì)與生物篩選模型篩選得到的化合物G8，可以克服由于GR 高表達(dá)造成的現(xiàn)有抗雄激素治療藥物耐藥問題，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

雄激素受體； 糖皮質(zhì)激素受體； 耐藥性前列腺癌； 恩雜魯胺

前列腺癌是西方國(guó)家男性中發(fā)病率最高的癌癥類型[1]。在中國(guó)男性群體中，前列腺癌發(fā)病率近年來呈現(xiàn)快速增加的趨勢(shì)[2]。去勢(shì)治療（androgen deprivation therapy，ADT）是晚期前列腺癌患者的常用治療方案，但很大比例的經(jīng)ADT 治療的晚期前列腺癌患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)并最終發(fā)展成為致死性的轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC），其特征為腫瘤可以通過細(xì)胞內(nèi)合成的睪酮或二氫睪酮（5α-dihydrotestosterone，DHT）激活雄激素受體（androgen receptor，AR）進(jìn)而生長(zhǎng)增殖[3]。恩雜魯胺（enzalutamide，Enza）是新一代的AR 拮抗劑，它可以通過與AR 直接結(jié)合進(jìn)而拮抗其轉(zhuǎn)錄功能，抑制AR 下游靶基因的表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)晚期前列腺癌患者的生存期[4-5]。

隨著恩雜魯胺在臨床中的廣泛應(yīng)用，關(guān)于其固有或獲得性耐藥的報(bào)道越來越多[6-7]。有研究表明，恩雜魯胺阻斷AR 信號(hào)通路后，可以引起糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoids receptor，GR）的高表達(dá)，高表達(dá)的GR 可以使約50% 的被恩雜魯胺抑制的AR 調(diào)控基因重新表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖[8]。研究顯示GR 激動(dòng)劑地塞米松（dexamethasone，Dex）可以導(dǎo)致恩雜魯胺耐藥，但GR 拮抗劑則可以使GR 高表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞恢復(fù)對(duì)恩雜魯胺的敏感性[9-10]。有報(bào)道稱另外一種AR 信號(hào)通路抑制劑阿比特龍也可以導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞中GR 的表達(dá)量升高[9]，這意味著GR 信號(hào)通路的過度激活是抗雄激素治療中一種常見的耐藥機(jī)制。因此，同時(shí)阻斷AR 與GR 信號(hào)通路可能是克服在抗雄激素治療過程中出現(xiàn)的GR 高表達(dá)相關(guān)耐藥性問題的有效策略。

多靶點(diǎn)藥物策略近年來日益受到研究者的關(guān)注，尤其是針對(duì)癌癥、神經(jīng)退行性疾病以及心血管疾病等發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的疾病，多靶點(diǎn)藥物擁有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[11]。近期有研究者報(bào)道，吡咯咪唑聚酰胺ARE-1 可以同時(shí)抑制AR 與GR 的轉(zhuǎn)錄活性，并且ARE-1 可以抑制恩雜魯胺耐藥性腫瘤模型的體內(nèi)增殖活性[12]。另外AR 與GR 同屬于核受體超家族中的3-類固醇受體家族，兩個(gè)蛋白的配體結(jié)合區(qū)具有高度的氨基酸序列相似性，尤其是在配體結(jié)合區(qū)內(nèi)的荷爾蒙結(jié)合口袋區(qū)域（hormone binding pockets，HBP），兩者具有高度的氨基酸序列與蛋白空間結(jié)構(gòu)的相似性。因此，設(shè)計(jì)同時(shí)靶向AR 與GR 的多靶點(diǎn)藥物，用于治療由于GR 過表達(dá)造成的抗雄激素治療耐藥性mCRPC 具有較高可行性。

通過理性藥物設(shè)計(jì)方法，結(jié)合現(xiàn)有抗雄激素藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與GR 的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，我們構(gòu)建了AR 與GR 雙靶點(diǎn)拮抗劑的虛擬篩選模型與活性評(píng)價(jià)系統(tǒng)。從本單位“國(guó)家新藥（微生物）篩選中心樣品庫(kù)”約4 萬個(gè)小分子化合物中篩選確定了G8 為活性較好的AR 與GR 雙靶點(diǎn)拮抗劑。化合物G8 為治療GR 高表達(dá)耐藥性mCRPC 提供了先導(dǎo)物。我們的工作證明了理性藥物設(shè)計(jì)是開發(fā)AR 與GR 雙靶點(diǎn)拮抗劑的有效策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 wt-AR 質(zhì)粒由加拿大麥吉爾大學(xué)惠贈(zèng)，含有pCMV 啟動(dòng)子，表達(dá)野生型全長(zhǎng)AR 蛋白。PSA-luc 質(zhì)粒由日本癌癥化療中心Hiroyuki 教授惠贈(zèng)，共表達(dá)前列腺特異性抗原和螢火蟲熒光素酶。pCMV-Renilla 質(zhì)粒是本科室所有，表達(dá)海腎熒光素酶。MMTV-luc 質(zhì)粒由加拿大麥吉爾大學(xué)惠贈(zèng)，共表達(dá)小鼠乳癌病毒和螢火蟲熒光素酶。

1.1.2 試劑

1.1.2.1 生化試劑 F-12K、RPMI1640 培養(yǎng)基、無酚紅 RPMI1640 培養(yǎng)基、FBS、活性炭處理FBS、含EDTA 的0.25% 胰酶、PBS 均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Lipofectamine 2000 DNA 轉(zhuǎn)染試劑和MTT 試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；雙熒光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。

1.1.2.2 抗體 β-actin 鼠單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；GR 鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

1.1.2.3 藥品 DHT 由加拿大麥吉爾大學(xué)惠贈(zèng)；Enza 由上海藥物所惠贈(zèng)；Dex、米非司酮（mifepristone，Mif）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；G8 初篩來自本單位“國(guó)家新藥（微生物）篩選中心樣品庫(kù)”，后續(xù)購(gòu)買自上海陶素生化科技有限公司。

1.1.3 儀器 Centro XS3 LB 960 酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)Berthold 公司；EnSpire 2300 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer 公司；凝膠成像儀Gel Doc?XR+ 購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 LNCaP 細(xì)胞 LNCaP 細(xì)胞（CRL-1740）購(gòu)于ATCC，用含有10% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，按1:2 或1:3 傳代，3 ~ 4 d 傳一次。

1.2.1.2 PC-3 細(xì)胞 PC-3 細(xì)胞（CRL-1435）購(gòu)于ATCC，用含有10% FBS 的F-12K 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，按1:3 ~1:5 傳代，2 ~ 3 d 傳一次。

1.2.1.3 22Rv1細(xì)胞 22Rv1 細(xì)胞（CRL-2505）購(gòu)于ATCC，用含有10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，按1:3 ~1:5 傳代，3 ~ 4 d 傳一次。

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 檢測(cè)化合物對(duì)內(nèi)源性AR 的轉(zhuǎn)錄抑制活性 在24 孔板中，接種1.6 × 105個(gè)/ml 的LNCaP 細(xì)胞懸液，每孔接種500 μl。24 h后，每孔共轉(zhuǎn)染100 ng PSA-luc 和1 ng pCMV-Renilla 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后6 h 將培養(yǎng)基換成含10% 活性炭處理的FBS 的無酚紅 RPMI1640 培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24 h 后，每孔按照1 nmol/L DHT 和相應(yīng)藥物各加入1 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。最后將培養(yǎng)基吸掉，每孔加入100 μl的1 × PLB 裂解20 min，收集細(xì)胞裂解物到干凈的EP 管中，離心，取上清20 μl到干凈的白色96 孔板中，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒的操作指南測(cè)定熒光值。

1.2.2.2 檢測(cè)化合物對(duì)外源轉(zhuǎn)入AR 的轉(zhuǎn)錄抑制活性 在24 孔板中，接種1.4 × 105個(gè)/ml 的PC-3 細(xì)胞懸液，每孔接種500 μl。24 h 后，每孔共轉(zhuǎn)染100 ng PSA-luc、20 ng wt-AR 和1 ng pCMV-Renilla 質(zhì)粒，后續(xù)操作同1.2.2.1。

1.2.2.3 檢測(cè)化合物對(duì)內(nèi)源性GR 的轉(zhuǎn)錄抑制活性 在24 孔板中，接種1.4 × 105個(gè)/ml 的PC-3 細(xì)胞懸液，每孔接種500 μl。24 h 后，每孔共轉(zhuǎn)染100 ng MMTV-luc 和1 ng pCMV-Renilla 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24 h 加藥時(shí)，每孔按照100 nmol/L Dex 和相應(yīng)藥物各加入1 μl，后續(xù)其他操作同1.2.2.1。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的22Rv1 細(xì)胞，制成2 × 104個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，每孔接種200 μl。培養(yǎng)24 h 后，每孔加入1 μl 相應(yīng)的藥物，每組藥物做3 組平行，同時(shí)以DMSO 為空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加入20 μl 用PBS 配制的5 g/L 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄上清，每孔用100 μl 異丙醇溶解沉淀物，96 孔板振蕩器上混勻20 min，最后用EnSpire 2300 多功能酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。

1.2.4 免疫印跡（Western blot） 接種3 × 105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液于6 孔板中，培養(yǎng)72 h，吸棄培養(yǎng)基，加入80 μl 預(yù)冷RIPA（強(qiáng)）裂解液，刮取6 孔板中細(xì)胞，收集到1.5 ml EP 管中。冰浴裂解30 min，每隔10 min 振蕩混勻一次。加入20 μl 5 × 蛋白上樣緩沖液，金屬浴煮30 min 制樣，10% SDS-PAGE 分離蛋白樣品。70 V 恒壓濕法轉(zhuǎn)膜80 min 后（采用PVDF 膜），5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h。先后與一抗和二抗孵育，然后ECL 顯色。抗體使用濃度為GR（1:1000），β-actin（1:5000），山羊抗兔（1:5000），山羊抗小鼠（1:5000）。

1.2.5 虛擬篩選 使用Discovery Studio 3.5 軟件中的“prepare ligands”模塊將本單位“國(guó)家新藥（微生物）篩選中心樣品庫(kù)”中的化合物分子生成三維結(jié)構(gòu)，使用本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的AR 拮抗劑分子共同特征藥效團(tuán)模型Pharmacophore_8[13]，利用Discovery Studio 3.5 進(jìn)行基于藥效團(tuán)模型的虛擬篩選，取Fitvalue 大于3 的化合物分子。從PDB 網(wǎng)站（www.pdb.org）下載GR 蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB 編碼：4MDD），以其HBP 位點(diǎn)自帶配體為中心、12 nm 為半徑的球體作為對(duì)接位點(diǎn)，使用GOLD 軟件對(duì)接，取分值排名在前300 的分子，進(jìn)一步人工挑選出結(jié)構(gòu)新穎的候選分子進(jìn)行活性初篩。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.01 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用檢驗(yàn)，以0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 AR 與 GR 轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)模型的構(gòu)建

AR 可被DHT 激活，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核觸發(fā)一系列的下游反應(yīng)，PSA 是AR 調(diào)控的關(guān)鍵下游靶基因之一，因此檢測(cè)PSA 的表達(dá)量可用以評(píng)價(jià)AR 的轉(zhuǎn)錄活性，MMTV 則可以用來評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)GR 的轉(zhuǎn)錄活性，基于此，首先構(gòu)建了可以評(píng)價(jià)AR 和GR 轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞檢測(cè)模型。PC-3 細(xì)胞是AR 陰性的前列腺癌細(xì)胞系，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該細(xì)胞可以大量表達(dá)GR，LNCaP 是AR 陽性細(xì)胞系，細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)GR，而對(duì)恩雜魯胺耐藥的AR 陽性細(xì)胞系22Rv1 細(xì)胞則可以表達(dá)GR（圖1A）。在PC-3 中轉(zhuǎn)入AR 質(zhì)粒使其可以表達(dá)野生型AR 蛋白，圖1B 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，DHT 可以激活A(yù)R 轉(zhuǎn)錄活性，從而提高PSA表達(dá)水平約3.8 倍，而作為陽性對(duì)照的第二代AR 拮抗劑恩雜魯胺則可以抑制AR 的轉(zhuǎn)錄活性，使得PSA 表達(dá)量下降至空白組水平。在AR 陽性的LNCaP 細(xì)胞中，我們觀察到了同樣的現(xiàn)象（圖1C），以上兩組實(shí)驗(yàn)證明該實(shí)驗(yàn)體系可用來評(píng)價(jià)化合物對(duì)AR 轉(zhuǎn)錄活性的影響。PC-3 細(xì)胞是GR 陽性前列腺癌細(xì)胞系，MMTV 可以被GR 激活從而表達(dá)量上調(diào)，圖1D 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GR 激動(dòng)劑地塞米松激活GR 轉(zhuǎn)錄活性后使得MMTV 表達(dá)量相較于空白組升高約6.6 倍，而在陽性藥GR 拮抗劑米非司酮處理組中，GR 轉(zhuǎn)錄活性被幾乎100% 的抑制，證明該實(shí)驗(yàn)體系可用來評(píng)價(jià)化合物對(duì)GR 轉(zhuǎn)錄活性的影響。

2.2 虛擬篩選與先導(dǎo)物的確定

利用目前文獻(xiàn)報(bào)道或已上市的6 個(gè)AR 拮抗劑的分子結(jié)構(gòu)，我們實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了AR 拮抗劑分子共同特征藥效團(tuán)模型Pharmacophore_8。利用該模型，對(duì)本單位“國(guó)家新藥（微生物）篩選中心樣品庫(kù)”中40618 個(gè)化合物分子首先進(jìn)行了基于藥效團(tuán)模型的虛擬篩選，得到了909 個(gè)匹配度大于3 的化合物分子，隨后利用GOLD 對(duì)接軟件，對(duì)909 個(gè)分子進(jìn)行了基于GR 蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB 編號(hào)：4MDD）的對(duì)接，對(duì)打分排名前300 的化合物，利用可視化篩選最終挑選了165 個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的分子進(jìn)行活性初篩。初篩結(jié)果顯示化合物G8（圖 2A）具有潛在的AR 與GR 雙靶點(diǎn)拮抗活性，且G8 的分子結(jié)構(gòu)與Pharmacophore_8 匹配度較高（圖2B）。

2.3 G8 具有 AR 與 GR 雙靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄抑制活性

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)化合物G8 對(duì)AR 與GR 的雙靶點(diǎn)拮抗水平，我們利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)首先檢測(cè)了不同濃度的G8 對(duì)AR 的轉(zhuǎn)錄抑制活性，圖3A顯示，在PC-3 細(xì)胞中，G8 可以劑量依賴性地抑制外源性AR 轉(zhuǎn)錄水平，同樣的，G8 對(duì)于內(nèi)源性AR 也顯示出了較好的劑量依賴性抑制活性（圖3B），在20 μmol/L 濃度處理下，G8 對(duì)外源與內(nèi)源性AR 的抑制水平均接近100%，且G8 在5 μmol/L 濃度下仍對(duì)外源與內(nèi)源性AR有顯著抑制。圖3C顯示，G8 可以劑量依賴性地抑制內(nèi)源性GR 的轉(zhuǎn)錄水平，在20 μmol/L 濃度處理下，G8 對(duì)內(nèi)源性GR 的轉(zhuǎn)錄抑制率約為61.3%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，G8 可以同時(shí)抑制AR 與GR 的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制這兩個(gè)信號(hào)通路的功能。

2.4 G8 可以抑制 GR 高表達(dá)的恩雜魯胺耐藥性前列腺癌細(xì)胞增殖活性

為了確定G8 是否可以克服由于GR 高表達(dá)造成的恩雜魯胺耐藥性問題，我們利用MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了G8 對(duì)GR 高表達(dá)的恩雜魯胺耐藥性AR陽性前列腺癌細(xì)胞22Rv1 的增殖抑制活性。圖4顯示，恩雜魯胺對(duì)22Rv1 細(xì)胞的增殖抑制活性很弱（IC50> 50 μmol/L），但G8 卻可以抑制22Rv1 細(xì)胞的增殖活性（IC50= 10.2 μmol/L）。結(jié)果顯示，通過同時(shí)阻斷AR 與GR 的轉(zhuǎn)錄活性，G8 對(duì)于GR 高表達(dá)造成的恩雜魯胺耐藥性前列腺癌仍具有增殖抑制活性。

圖 1 AR 與GR 轉(zhuǎn)錄活性評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建（A：Western blot 檢測(cè)不同前列腺癌細(xì)胞系中GR 的表達(dá)水平；B：檢測(cè)化合物對(duì)外轉(zhuǎn)AR 轉(zhuǎn)錄活性影響的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)；C：檢測(cè)化合物對(duì)內(nèi)源性AR 轉(zhuǎn)錄活性影響的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)；D：檢測(cè)化合物對(duì)內(nèi)源性GR 轉(zhuǎn)錄活性影響的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

Figure 1 Construction of AR and GR transcription activity evaluation models (A: GR expression levels in different prostrate cancer cells detected by Western blot; B: Dual-luciferase reporter system that test the exogenous AR transcription inhibition activity;C: Dual-luciferase reporter system that test the endogenous AR transcription inhibition activity; D: Dual-luciferase reporter system that test the endogenous GR transcription inhibition activity;*0.05,**0.01,***0.001)

圖 2 AR 與GR 雙靶點(diǎn)拮抗劑G8 的分子結(jié)構(gòu)（A）與藥效團(tuán)模型_8 的匹配度（B）

Figure 2 Structure of AR and GR dual antagonist G8 (A) and its matched degree of pharmacophore_8 (B)

3 討論

晚期去勢(shì)抵抗前列腺癌患者在接受抗雄激素治療過程中，耐藥性問題一直是制約患者生存期的重要因素。為了克服由于GR 高表達(dá)造成的抗雄激素治療耐藥性問題，我們通過理性藥物設(shè)計(jì)方法，首先利用目前已有的AR 拮抗劑分子，構(gòu)建了基于分子共同特征的藥效團(tuán)模型，隨后我們開展了基于AR 拮抗劑分子共同特征藥效團(tuán)模型的虛擬篩選以及基于GR 蛋白結(jié)構(gòu)的對(duì)接篩選，從篩選得到的分子中，我們挑選了部分結(jié)構(gòu)較新穎的分子進(jìn)行了活性初篩，初步確定了化合物G8 為候選分子。隨后的實(shí)驗(yàn)證明，通過同時(shí)阻斷AR 與GR 的轉(zhuǎn)錄活性，G8 可以抑制GR 高表達(dá)造成的恩雜魯胺耐藥性前列腺癌細(xì)胞的增殖活性，為后續(xù)開發(fā)AR 與GR 雙靶點(diǎn)拮抗劑治療耐藥性前列腺癌提供了結(jié)構(gòu)先導(dǎo)物。

圖 3 不同濃度G8 對(duì)AR 與GR 的轉(zhuǎn)錄抑制活性（A：G8 對(duì)外源性AR 的轉(zhuǎn)錄抑制活性；B：G8 對(duì)內(nèi)源性AR 的轉(zhuǎn)錄抑制活性；C：G8 對(duì)內(nèi)源性GR 的轉(zhuǎn)錄抑制活性；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

Figure 3 AR and GR transcription inhibition activity of different concentration of G8 (A: Exogenous AR transcription inhibition activity of G8; B: Endogenous AR transcription inhibition activity of G8; C: Endogenous GR transcription inhibition activity of G8;*0.05，**0.01，***0.001)

圖 4 G8 對(duì)去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞 22Rv1 細(xì)胞的增殖抑制活性

Figure 4 The 22Rv1 cells proliferation inhibition activity of G8

多靶點(diǎn)藥物成為新藥開發(fā)越來越重要的方向之一，例如阿比特龍通過作用于CYP17、3β-HSD 以及AR 來發(fā)揮抗前列腺癌活性。但值得注意的是，研發(fā)同時(shí)特異性靶向兩個(gè)甚至多個(gè)靶點(diǎn)的藥物在實(shí)際操作中具有更高的難度。我們的研究證明，通過綜合利用靶點(diǎn)與配體的信息，聯(lián)合藥效團(tuán)模型虛擬篩選以及基于蛋白結(jié)構(gòu)的虛擬篩選的理性藥物設(shè)計(jì)方法，在開發(fā)多靶點(diǎn)藥物領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Construction and application of a drug screening model for anti-prostate cancer agents targeting androgen receptor and glucocorticoids receptor

WU Meng, XIE Yong-li, CUI Xiang-ling, ZHOU Jin-ming, CEN Shan

Laboratory of Immunology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (WU Meng, XIE Yong-li, CUI Xiang-ling, CEN Shan); Drug Discovery & Innovation Center, College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China (ZHOU Jin-ming)

To find agents that could overcome drug resistance of antiandrogens caused by GR over expression.

In silico screening was performed to screen our compounds database, dual-luciferase reporter systems were used to evaluate the influence of compounds on AR and GR transcription activity, 22Rv1 cell proliferation inhibition activity of the lead compound G8 was detected by MTT assay.

The AR and GR transcription inhibition activity evaluation model was constructed successfully. Compound G8 screened by our model could inhibit AR and GR transcription activity and inhibit 22Rv1 cell proliferation activity.

This study demonstrates that compound G8 screened through rational drug design and bioactivity evaluation, overcomes drug resistance of antiandrogens caused by GR over expression.

Androgen receptor; Glucocorticoids receptor; Drug resistance prostate cancer; Enzalutamide

ZHOU Jin-ming, Email: zhoujinming@zjnu.edu.cn; CEN Shan, Email: shancen@hotmail.com

國(guó)家自然科學(xué)基金（81672559）

周金明，Email：zhoujinming@zjnu.edu.cn；岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.006

2020-01-07