藜麥WOX轉錄因子家族的鑒定及表達分析

朱滿喜，楊雅舒，楊小蘭，張 芳，楊利艷，王創云

(1.山西師范大學生命科學學院， 中國 臨汾 041000；2.山西省農業科學院作物科學研究所， 中國 太原 030031)

WOX (WUSCHEL-related homeobox) 轉錄因子是植物特有的轉錄因子，對植物干細胞穩態維持、胚胎發生與胚胎后發育、激素信號轉導、初生和次生物質代謝及抗逆響應等均起著重要的調節作用[1]。WOX家族成員在擬南芥、棉花、水稻、玉米、番茄等植物中已得到鑒定，證實它是一類廣泛存在的轉錄因子[2]。擬南芥WOX基因家族中包含WUS和WOX1～WOX15[3]，棉花中發現有37個成員[4]，水稻和番茄中分別發現有12個、10個成員[5，6]。系統發育樹分析發現，WOX家族蛋白被分為進化支(WUS支)、中間支、古老支3個分支，其中中間支和古老支的起始氨基酸不固定，進化支成員有固定的起始氨基酸，為T-L[2]。對WOX的功能研究表明，擬南芥的WUS和WOX5分別在莖尖和根尖的分生組織表達，維持干細胞的分裂能力，抑制分化，其中WUS基因通過影響子房和花藥的發育促進葉和花序的形成[7-10]。AtWOX3功能保守，與花瓣的形成有關，并參與營養器官的發育過程[11，12]。AtWOX4在原形成層發育過程中通過識別不同的DNA靶點和互作蛋白而影響維管束的形成[13]。AtWOX9將發育信號與細胞周期調控相結合，在維持細胞分裂和防止細胞過早分化中起重要作用[14]。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是起源于安第斯山脈的莧科藜亞科藜屬植物，已有7千年的種植歷史，稱為“偽谷物”，其營養全面，油脂、蛋白質組成平衡，是被FAO認定的唯一一種單作物即可滿足人類所需全部營養的食品，是一種極具潛力的世界性糧食作物[15]。藜麥不僅營養豐富，其特殊的生長環境使藜麥同時具有較強的耐鹽、耐旱、耐貧瘠等特性[16，17]。

高質量藜麥基因組數據的公布極大地促進了對藜麥重要基因家族功能的研究[18]。本研究利用生物信息學方法和轉錄組技術獲得藜麥WOX家族成員，并對其理化性質、系統進化、基因結構、保守結構域、保守基序、組織表達特異性和氮脅迫下基因表達進行分析，為理解WOX基因家族在藜麥生長發育過程中的功能奠定基礎，同時為篩選響應低氮脅迫WOX基因提供線索。

1 材料與方法

1.1 轉錄組和基因組數據來源

RNA-Seq數據下載于NCBI，擬南芥WOX蛋白下載于擬南芥全基因組數據庫 TAIR(https://www.arabidopsis.org/)，水稻WOX蛋白下載于水稻全基因組數據庫RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，藜麥基因組數據從Phytozome v12 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/)中的Chenopodium quinoa v1.0獲得。

1.2 藜麥WOX基因家族成員的鑒定及序列分析

利用TAIR數據庫中已經鑒定的所有擬南芥WOX家族蛋白，通過藜麥基因組數據庫進行Blastp比對搜索，篩選出藜麥中所有的WOX 轉錄因子家族蛋白，運用Pfam(http://pfam.xfam.org/)分析候選WOX蛋白結構，去除無WOX蛋白典型保守結構域的成員，最終得到WOX轉錄因子家族的所有成員。

將WOX家族的所有蛋白序列輸入ExPasy 網站(http://au.expasy.org/tool.html)，使用Compute pI/MW功能對蛋白序列的長度、相對分子質量、等電點等理化性質進行分析。

1.3 系統進化樹構建

利用BioEdit軟件的Clustal W功能對藜麥、擬南芥和玉米的WOX蛋白序列進行多重比對，使用MEGA7 軟件(鄰接法)(bootstrap=1 000)構建無根進化樹。

1.4 藜麥WOX基因結構分析

將藜麥WOX基因的CDS序列和全長序列輸入GSDS 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)網站，對其基因結構進行分析。

1.5 藜麥WOX蛋白的保守域、保守基序分析

藜麥WOX蛋白保守域用DNAMAN 6.0軟件進行分析。通過Pfam網站獲得藜麥WOX蛋白保守域的氨基酸起始位置，以此在IBS軟件中繪制結構域位置圖。通過MEME網站 (http://memesuite.org/tools/meme)對藜麥WOX 蛋白保守基序進行分析。參數如下：基序數目(Motif number)設置為10，基序寬度(motif width)設置為6～100。并運用TBtools軟件繪制Motif位置圖。

1.6 藜麥WOX基因表達分析

1.6.1 表達的組織特異性 藜麥種子和6周齡葉片、莖、幼苗的RNA-Seq數據下載于NCBI數據庫，以此來分析藜麥各組織的表達情況。運用TBtools軟件繪制藜麥WOX基因表達的熱圖(表達量取log2TPM值)。

1.6.2 藜麥WOX家族成員響應氮脅迫的表達分析 以藜麥品種ZK7(Chenopodiumquinoacv. ZK7)為材料，進行不同氮素水平下的WOX基因表達分析。藜麥種子由山西省農業科學院作物科學研究所提供。用10%次氯酸鈉溶液消毒5 min，沖洗干凈后將種子置于濕潤的濾紙上，發芽后置于人工氣候培養箱，用Hoagland全營養液(N濃度：7.1 mmol/L)培養，培養條件為光照 16 h，黑暗 8 h，溫度為23 ℃。幼苗長到6～8葉后，選取生長一致的幼苗進行以下處理。低氮處理：20%N Hoagland營養液培養，N濃度為1.42 mmol/L；缺氮處理：0%N Hoagland營養液處理，N濃度為0；以Hoagland全營養液處理(N濃度為7.1 mmol/L)為對照。處理時間設置為5 d和30 d。每個處理設 3個生物學重復。采集的幼苗葉片立即置于液氮中速凍，送至北京百邁客生物科技有限公司進行有參轉錄組分析。

2 結果與分析

2.1 藜麥WOX基因家族成員的鑒定及序列分析

利用已經鑒別出的所有擬南芥WOX蛋白，通過Phytozome藜麥蛋白數據庫進行Blastp比對，Pfam網站去除無WOX蛋白典型保守結構域的蛋白，共鑒定出13個藜麥WOX蛋白家族成員，并獲得了每個成員的全基因序列、CDS序列及相應的蛋白序列(表1)。對藜麥WOX蛋白理化性質分析發現，不同藜麥WOX蛋白存在較大差異，蛋白序列長度為159～676 aa，相對分子質量為18 510～76 730。蛋白序列越長，相對分子質量越大(AUR62009597最大，AUR62017610最小)。蛋白質等電點為5.27～9.56，其中AUR62035466最高，AUR62003747最低，等電點大于7的蛋白質共有5個，為堿性蛋白，其余8個蛋白質均為酸性蛋白。藜麥WOX家族蛋白質具有不同的理化性質，推測它們可能具有不同的功能。

表1 藜麥WOX基因家族成員基本信息Tab. 1 Basic information of WOX gene family members in quinoa

2.2 藜麥、擬南芥與水稻WOX 家族蛋白系統發育樹分析

為了解藜麥WOX家族的演化關系，將擬南芥、水稻和藜麥的WOX蛋白序列進行多重比對，構建一個無根的NJ系統發育樹(圖1)。根據發育樹分支結果，13個藜麥WOX 蛋白、12個水稻WOX 蛋白、14個擬南芥WOX 蛋白分為3組，即Class A，Class B和Class C(圖1)。17個WOX 蛋白被分到Class A組 (包括7個藜麥WOX 蛋白)， 8個WOX 蛋白被分到Class B 組(包括2個藜麥WOX 蛋白)，14個WOX 蛋白被分到Class C組 (包括4個藜麥WOX 蛋白)。擬南芥WOX蛋白分為遠古支、中間支和進化支，其中遠古支包含WOX10，WOX13及WOX14共 3個成員，中間支包含WOX8，WOX9，WOX11和WOX12共4個成員，進化支包含WOX1～WOX7共7個成員[8]。據此可知，藜麥WOX基因有2個屬于遠古支、4個屬于中間支、7個屬于進化支。3個物種的WOX家族成員在3個分支中均有分布，說明WOX家族的分化在藜麥、擬南芥、水稻物種分化之前。

圖1 藜麥、擬南芥和水稻WOX 蛋白系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of WOX family in quinoa, Arabidopsis, and rice

2.3 藜麥WOX基因家族結構分析

基因結構能為基因家族的進化規律提供進一步的證據。從Phytozome v12中獲得藜麥WOX基因的CDS序列和全基因組序列，利用GSDS 2.0網站對其基因結構進行分析，結果表明(圖2)：不同WOX基因結構存在較大差異，成員內含子數目為1～4個，外顯子數目為2～5 個，不同的進化支之間差異較大；只有AUR62003747，AUR62031363及AUR62035466同時存在5′非翻譯區和3′非翻譯區，AUR62002048只含有5′非翻譯區，AUR62014909只具有3′非翻譯區，其余8個WOX基因不存在非翻譯區。

圖2 藜麥WOX基因家族進化樹與基因結構Fig. 2 Phylogenetic tree and gene structure of WOX gene family in quinoa

2.4 藜麥WOX家族基因保守結構域、保守基序分析

13個基因中存在6組旁系同源基因，每一組旁系同源基因的結構相似。如AUR62031363和AUR62035466作為一對同源基因，都含有3個外顯子、2個內含子，并且同時存在5′非翻譯區和3′非翻譯區；AUR62014909和AUR62031114是一對同源基因，都有4個外顯子、3個內含子，但AUR62014909存在3′非翻譯區，AUR62031114則沒有。不同進化支內成員的外顯子、內含子數目不同，AUR62031114，AUR62002048及AUR62001809分別含有4，2及5個外顯子。WOX基因家族進化過程中外顯子數目的變化可能是WOX基因功能多樣性的主要原因。

對藜麥WOX蛋白序列進行分析表明，13個WOX蛋白均含有Homeobox結構域，且均位于蛋白質的N端；同源基因的蛋白長度和保守結構域的位置都具有一定的相似性(圖3)。將Homeobox結構域的氨基酸序列進行多重比對，進一步分析藜麥WOX蛋白Homeobox結構域的保守性，發現Homeobox結構域由34～60個氨基酸組成，其具有螺旋-環-螺旋-轉角-螺旋結構 (T-L-X-L-F-P-X-X, 其中X代表任一氨基酸)，并且多個氨基酸位點具有保守性(圖4)，推測這些位點的氨基酸殘基在藜麥WOX家族基因的表達中起重要作用。

圖3 藜麥WOX蛋白保守結構域分析Fig. 3 Analysis of conserved domain of WOX proteins in quinoa

圖4 藜麥WOX蛋白Homeobox結構域的氨基酸序列比對Fig. 4 Amino acid sequence alignment of Homeobox domain of WOX proteins in quinoa

對鑒定的藜麥WOX家族成員的保守基序分析表明，共鑒定出10個獨立的Motif，命名為Motif 1～Motif 10(表2)。其中Motif 1位于5′端，存在于所有的藜麥WOX蛋白中，保守性較高；Motif 6為WUS-box 基序(TLXLTP)，存在于Class B和Class C 所有成員中，而在Class A 支中未預測到；Motif 9和Motif 10的保守性不高，僅存在于AUR62001809和AUR62009597這一對同源基因中(圖5)。

圖5 玉米WOX蛋白Motif分析Fig. 5 Motif analysis of WOX proteins in quinoa

表2 Motif氨基酸序列Tab. 2 Amino acid sequence of Motif

2.5 藜麥WOX基因家族的表達分析

2.5.1 組織特異性 為明確藜麥WOX基因在不同組織中的表達特性，對6 周齡的莖、葉、幼苗和種子4個組織器官中的13個WOX基因的表達情況進行分析。結果表明，不同藜麥WOX基因在不同組織中表達差異明顯(圖6，彩圖見封三)。AUR62012213，AUR62022846，AUR62009597，AUR62001809及AUR62017610在莖、葉、幼苗、種子中都未見表達，推測這5個基因與以上器官的生長發育關系不大，其組織表達特性有待進一步驗證。在其余7個WOX基因中，除AUR62031363在種子中不表達外，其它WOX基因均在種子中有表達, 說明這些基因可能與藜麥種子的發育有關；AUR62043402，AUR62014909，AUR62031114及AUR62042276只在種子中表達，說明這些基因對藜麥種子的發育有重要調控作用；AUR62003747和AUR62002048在葉中表達量較高，即這2 個基因可能參與了藜麥葉的發育過程;AUR6200374，AUR62031363，AUR62035466及AUR62002048均在莖中表達量最高，它們可能對藜麥莖的生長有重要作用。綜上可知，藜麥WOX基因具有明顯的組織表達特異性，在莖中的表達量最高, 其次是種子和葉, 在幼苗中的表達量最低, 暗示它們在藜麥不同組織中的生物學功能可能存在較大差異。

圖6 WOX基因在藜麥不同組織中的表達模式分析Fig. 6 Expression profile analysis of WOX genes in different tissues of quinoa

2.5.2 藜麥WOX基因家族成員響應氮脅迫的表達分析 根據轉錄組測序結果分析，13個藜麥WOX基因中AUR62031363，AUR62003747及AUR62035466對氮脅迫有顯著響應。低氮條件下，AUR62031363和AUR62035466基因的表達量在5 d和30 d均較對照提高，即低氮誘導了二者的表達，特別是在處理30 d后，這兩個基因的表達急劇上升，AUR62035466尤為明顯，表達量增加272%。在缺氮條件下，AUR62031363和AUR62035466基因表達量較低氮下明顯下降，處理30 d時，二者的表達量分別降低54.9%和57.7%。AUR62003747則有不同的表達模式，低氮和缺氮處理均抑制了該基因的表達：5 d時，AUR62003747的表達量隨氮脅迫加深而降低；30 d時，其表達量有所上升。

注：基因表達量以FPKM值表示。圖7 不同氮素水平下藜麥WOX基因的表達Fig. 7 Expression profile of WOX genes in quinoa seedling leaves under different nitrogen levels

3 討論

近年來基因組測序技術飛速發展，為深入研究分子生物學創造了良好的條件，許多物種的全基因組被測定并陸續公布，為基因家族鑒定、功能基因挖掘和研究提供了便利。本研究通過生物信息學分析，共鑒定出13個藜麥WOX蛋白，比水稻有更多的WOX蛋白，可能與藜麥WOX基因在進化過程中經歷全基因組倍增事件有關[19]。對系統發育樹分析發現，7個藜麥WOX蛋白、7個擬南芥WOX蛋白、3個水稻WOX蛋白被分到Class A支，表明它們有共同的祖先，但在進化過程中WOX蛋白在水稻中出現丟失現象，而在藜麥和擬南芥中保留下來。分析藜麥WOX基因的結構發現，不同進化支的基因結構差異較大，同一進化支的基因結構有很高的保守性。大量基因家族分析表明，同一分支中的蛋白質其基序保守性很高，如MYB基因家族[20]，這也證明了本研究構建的進化樹的可靠性。

WOX轉錄因子在植物的生長發育過程中發揮著重要作用。通過分析藜麥WOX基因家族在不同組織中的表達數據, 發現藜麥WOX家族的基因在莖、葉、幼苗、種子中均有表達, 并且在莖中的表達量較高。AUR62031363和AUR62035466在莖中的表達量明顯高于其他WOX基因，它們在擬南芥中的同源基因AtWOX4可以調節原形成層分生組織的分化[13]，因此推測以上兩個基因可能對莖的生長和莖尖的分裂有重要作用[21]。AUR62043402，AUR62014909，AUR62031114和AUR62042276只在種子中表達，而AUR62043402和AUR62042276的同源基因AtWOX11和AtWOX12參與了葉片外植體新根器官的發生[22]，因此筆者推測該基因家族在藜麥和擬南芥中的功能發生了分化。

WOX轉錄因子還在植物響應非生物脅迫中起重要的調節作用[23，24]。前人研究表明，擬南芥AtWOX6突變株在冷脅迫中生長較慢，開花較晚，并且對冷凍更敏感[25]；水稻的根長受WOX11基因的調控，超表達WOX11可以增加水稻對干旱脅迫的抗性[26]。本研究轉錄組分析表明藜麥AUR62031363，AUR62003747和AUR62035466基因對氮脅迫有顯著響應，后期可作為氮脅迫響應的候選基因進一步驗證。綜上所述，藜麥WOX全基因組的鑒定和表達模式的分析可為深入研究WOX基因在藜麥生長發育和抗逆性響應提供基礎。

4 結論

在藜麥中共鑒定出13個WOX基因家族成員，分屬Class A，Class B和Class C亞族，具有典型的Homeobox保守結構域，組織表達特異性明顯，在莖中表達量最高。AUR62031363，AUR62003747和AUR62035466明顯受低氮脅迫誘導，但對低氮的響應程度不同。