寒泊羊群體中BMPR-IB基因多態性及其對胎產羔數的影響

馬曉菲，陳曉勇，劉愛菊，韓紅葉，孫歡，李清艷，敦偉濤，孫樹春，4，田樹軍，4*

(1. 河北農業大學動物科技學院，河北 保定 071000；2. 河北省畜牧獸醫研究所，河北 保定 071000；3. 河北農業大學科教興農中心，河北 保定 071000；4. 河北省牛羊胚胎工程技術研究中心，河北 保定 071000)

1994年在澳大利亞布魯拉美利奴羊群基因組中發現了與多胎性狀相關的FecB基因(fecundity booroola，FeeB)[1]，并通過進一步的克隆定位發現其所處區域同人的四號染色體上的骨形態發生蛋白受體IB(bone moorphogenetic IB,BMPR-IB)基因所處區域相同[2]。通過序列分析發現，BMPR-IB基因高度保守的胞內激酶信號區域的第746位堿基處發生了A→G突變，即FecB突變，此突變引起基因所編碼蛋白由谷氨酰胺變為精氨酸，導致BMPR-IB受體部分失活，使其天然配體生長分化因子5(growth differentiation 5,GDF-5)和骨形態發生蛋白4(bone morphogenetic 4,BMP-4)對顆粒細胞類固醇分泌的抑制作用下降，從而使顆粒細胞分化加快，排卵數增多。

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)是來自轉化生長因子β超家族(transforming growth factor beta superfamily,TGFβs)中的一類多肽蛋白。BMPs的受體屬于TGFβ受體超家族的成員，是一種具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構的膜蛋白受體，分為細胞外區、細胞內區和跨膜區[3]。目前發現的Ⅰ型受體和Ⅱ型受體都參與BMPs信號的傳導[4]。當BMPs、Ⅰ型受體與Ⅱ型受體形成復合物后，Ⅱ受體自身首先激活，然后進一步激活Ⅰ型受體的磷酸化；一旦Ⅰ型受體活化后，胞質中游離的受體調節Smads(receptor-activated smad,R-Smad)便向I型受體移動并激活磷酸化[5]。激活后的R-Smads從受體復合物上脫離后，迅速與共介導Smads(common mediator smad,Co-Smad)形成異源復合物，進行移位入核，與靶基因啟動子中的特定序列結合從而起到調控的作用[9]。

為了更好地了解BMPR-IB基因與綿羊多胎性狀的相關性，國內學者對不同品種綿羊和山羊進行了研究。研究結果表明，以一胎產多羔著稱的湖羊為BB型，肉用中國美利奴具有BB、B+、++3種基因型，夏洛萊、陶賽特、薩福克、中國美利奴則僅有++基因型[6]；小尾寒羊中發現了B基因的存在[7]，并證實B基因確實能提高小尾寒羊的胎產羔數[8]；濟寧青山羊以高的胎產羔數而馳名，也發現了BMPR-IB外顯子區域816 bp處發生了A→G突變，相應的蛋白質由谷氨酰胺變為精氨酸[9]。寒泊羊是以杜泊羊為父本，以小尾寒羊為母本，通過雜交、橫交固定、自群繁育等育種過程，歷經十余年而培育出的一個肉用綿羊新種群，目前主要分布于河北省部分地區，其生長速度、育肥效果及羊肉品質均優于小尾寒羊[10-11]。然而，目前寒泊羊的胎產羔數卻低于小尾寒羊，這在一定程度上限制了寒泊羊中試推廣羊只數量的增加及中試范圍的進一步擴大。

為此，本文開展了寒泊羊種群中BMPR-IB基因多態性及其對胎產羔數影響的研究，旨在探討用B基因作為提高寒泊羊胎產羔數性能及其標記基因的可行性，為今后寒泊羊的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試劑

1.1.1 試驗動物

選擇寒泊羊育種核心群的584只個體進行采血。

1.1.2 主要試驗試劑

血液基因組柱式小量提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)、2XES Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)、Sangon Biotech生工引物(上游引物：5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3′ 下游引物：5′-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3′)、AVaII酶。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

將新鮮血樣加入檸檬酸鈉抗凝劑放入4 ℃冰箱進行保存(長時間放置應放入-20 ℃保存)。使用血液基因組柱式小量提取試劑盒進行DNA的提取。提取出DNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增與產物檢測

PCR體系反應(25 μL):Mix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、ddH2O 13.2 μL、模板DNA 1 μL。使用1%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳抽檢，其中電泳電壓為80 V，電流強度為200 mA,時間為30 min。

1.2.3 PCR產物的酶切與RFLP分析

酶切體系：總體積10 μL。Buffer 1 μL、PCR產物3 μL、AVaII 1 μL、ddH2O 5 μL。反應體系：37 ℃水浴消化30 min，反應完畢進行電泳檢測。使用3%的瓊脂糖凝膠對酶切產物進行電泳，凝膠成像。其中電泳電壓為120 V，電流強度為200 mA,時間為30 min。

1.2.4 判定基因型

根據酶切與RFLP分析結果，判定寒泊羊個體的基因型，并調取寒泊母羊的個體產羔記錄，分析寒泊羊種群中BMPR-IB基因的多態性及其對胎產羔數的影響效果。

1.3 數據統計

使用EXCEL軟件整理數據，計算FecB基因的基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量(polymorphism information content，PIC)、雜合度(heterozygosity，He)、有效等位基因數(effective number of allele，Ne)，并進行Hardy-weinberg平衡檢驗；建立線性模型：Yijk=u+Pi+Gj+eijk，其中Yijk為產羔數記錄值，u為群體均值，Pi為第i個胎次的固定效應，Gj為第j種BMPR-IB基因型的固定效應，eijk為隨機殘差效應。使用SPSS軟件中的一般線性模型進行分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物電泳檢測結果

FecB基因片段大小為140 bp，電泳結果如圖1所示，其PCR擴增產物的電泳條帶清晰，與目的基因大小一致，表明PCR擴增產物質量較好。

M. DL800 bp Marker; 1. FecB基因擴增片段圖1 BMPR-IB基因PCR擴增產物電泳結果

2.2 酶切產物電泳結果

結果如圖2所示，酶切產物的電泳條帶清晰。BB基因型僅在110 bp處有一條帶；B+基因型有2條帶，分別在110 bp和140 bp處；++基因型(野生型)僅在140 bp條處有1條帶。

2.3 寒泊羊種群的胎產羔性能

對具有產羔記錄的998只次繁殖母羊的胎產羔數進行統計，寒泊母羊胎產羔分布情況如表1所示，胎產1羔的比例較高為48.5%，胎產3羔及以上的比例較低為13.62%。

表1 寒泊母羊胎產羔分布情況

2.4 BMPR-IB基因多態性及群體遺傳學分析

根據酶切產物電泳結果，各基因型頻率分布情況如表2所示。BMPR-IB基因在寒泊羊群體中有BB、B+和++3種基因類型，其基因型頻率以B基因和+的基因頻率較高，分別為33.33%和66.67%。

表2 基因型頻率分布

BMPR-IB基因在寒泊羊群體中屬于中度多態(0.25

表3 FecB基因在寒泊羊群體中的群體遺傳學分析

2.5 BMPR-IB基因型對胎產羔數的影響

對基因型明確母羊的胎產羔數情況進行統計，結果如表4所示。無論初產母羊還是經產田羊，BB和B+基因型的平均胎產羔數均高于++基因型；對于所有胎次的產羔數進行統計，BB和B+基因型的平均胎產羔數分別為2.04只和1.93只，++基因型的平均胎產羔數為1.44只。

表4 不同基因型平均胎產羔數

對各變量之間的相關性進行分析,結果如表5所示。胎次與產羔數在0.05水平上顯著相關(Sig.<0.05)，且呈正相關；母羊所攜帶的B基因的數量與產羔數在0.05水平上顯著相關(Sig.<0.05)，且呈相關。而胎次與母羊所攜帶的B基因數量之間并無顯著的相關性(Sig.>0.05)。通過以上相關性分析可知，隨著母羊胎次以及攜帶的B基因數量的增加，其產羔數也隨之增加。

表5 相關性分析

以胎產羔數為因變量，攜帶B基因數以及胎次為自變量，使用SPSS軟件建立多元線性回歸模型，模型擬合情況如表6所示。運用F檢驗法，在顯著水平0.05情況下，線性關系顯著(Sig.<0.05)。從相關系數進行檢驗，R為0.34，擬合優度中等。綜上，模型的擬合效果較好。

表6 方差分析

經過擬合度檢驗之后，進一步得到多元線性回歸系數列表，如表7所示。根據對應的系數得到模型預測方程：胎產羔數=0.415×攜帶B基因數量+0.320×胎次+0.978。根據容差和VIF進行共線性判斷可知，模型的共線性不明顯(VIF<20)。

表7 多元線性回歸系數

對建立的模型殘差統計量進行分析，其頻率分布直方圖和標準正態P-P圖如圖3和圖4所示。由圖可以看出，模型的標準化殘差基本呈正態分布，散點分布也較為靠近直線，具有較好的方差齊性和正態性。

圖3 回歸模型回歸標準化殘差的直方圖

圖4 回歸標準化的正態P-P圖

3 討論

3.1 寒泊羊的胎產羔性能

國內目前缺乏專用的肉用綿羊新品種，地方品種的產肉性能普遍劣于國外的肉用品種。從國外引進肉羊品種與地方品種進行雜交改良，成本高，其后代產羔率低，對粗放的飼養條件也不能很好適應，而且雜交體系較為復雜，在實際生產中易發生亂配現象從而丟失優秀性狀。因此，培育符合國情和農區養殖現狀的肉用新品種刻不容緩。小尾寒羊繁殖性能優越，杜泊羊產肉性能好，寒泊羊是以小尾寒羊為母本，杜泊羊為父本進行培育，旨在培育兼顧肉用性能和繁殖性能的肉用綿羊品種。近十余年，以多胎基因BMPR-IB作為分子標記進行選育，目的是提高其產羔數，同時對體型外貌進行嚴格篩選，目的是維持較好的產肉性能。有研究表明，寒泊羊的早期增重顯著好于小尾寒羊, 肉用體型較小尾寒羊顯著改善[12]，其繁殖性能較杜泊羊也有所改良，能夠常年發情配種產羔[13]。對寒泊母羊歷年胎產羔數記錄進行統計，其胎產羔率平均為168%。雖高于杜泊綿羊平均產羔率(136%)，但仍與小尾寒羊胎產羔率(260%)具有較大的差距。本研究對具有產羔記錄的998只繁殖母羊的胎產羔數進行統計，胎產1羔的比例為48.5%，胎產2羔的比例為37.88%，胎產3羔及以上的比例為13.62%，可見目前寒泊羊種群的胎產羔率在個體間存在較大差異，有希望通過增加選擇強度的途徑來提升胎產羔數及整齊度。

為了滿足肉羊集約化舍飼對繁殖母羊胎產羔數不低于2只并且胎產羔數量整齊一致的要求，因此如何有效提升母羊的胎產羔數并縮小寒泊羊胎產率這一繁殖技術指標的變異系數，將成為下一步進行寒泊羊品種選育亟待解決的問題。

3.2 寒泊羊群體中BMPR-IB基因的多態性及群體遺傳性分析

BMPR-IB基因作為多胎性狀的主效基因,在許多繁殖性能較為優秀的品種中都已被發現。湖羊作為中國特有的多胎品種全為BB型，具有多胎性能的小尾寒羊中也發現了突變型(B基因)的存在，以高的胎產羔數而馳名的濟寧青山羊也發現了BMPR-IB外顯子區域816 bp處發生了A→G突變[9]。肉用中國美利奴具有BB、B+、++3種基因型，夏洛萊、陶賽特、薩福克、中國美利奴則僅有++基因型[6]。可見，BMPR-IB基因的多態性在不同羊品種間存在較大差異。本研究結果顯示，BMPR-IB基因在寒泊羊群體中有BB、B+和++3種基因類型，其基因型頻率分別為16.66%、33.34%和50.00%。據此計算，B和+兩種基因在寒泊羊種群中的基因頻率目前分別為33.33%和66.67%，B基因較+基因的頻率明顯處于偏低水平。

BMPR-IB基因在寒泊羊群體中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態，屬于中度多態，說明人工以FecB基因為分子標記對寒泊羊進行選育有一定效果。有效等位基因數達到1.8，較為接近等位基因數的絕對值，雜合度0.44較低，說明人工選擇壓力較大。綜上數據說明，多年的選育確實提高了B基因的概率，但目前B基因的概率仍處于偏低水平，需進一步加強選擇強度。

3.3 BMPR-IB基因型對胎產羔數的影響

BMPR-IB基因高度保守的胞內激酶信號區域A746G突變，引起細胞內激酶區域的編碼蛋白由谷氨酰胺變為精氨酸，導致BMPR-IB部分失活，使其天然配體抑制顆粒細胞類固醇分泌的作用下降，類固醇濃度上升加速了顆粒細胞分化，從而促進了排卵，有利于提高胎產羔數。近年來，許多學者通過對攜帶FecB基因的高繁殖力母羊進行代謝機制和分子機制的研究發現，攜帶FecB基因的母羊允許較小的卵泡在促性腺激素分泌抑制期間存活，即更多的卵泡可發育成排卵卵泡[14]，從而顯著提高排卵數。本研究通過對繁殖母羊的胎產羔數進行統計也發現，B基因對胎產羔數具有正效應(相關系數為0.415)，且與胎次(相關系數為0.320)對胎產羔數的影響相比效果更加顯著，這與前人在其他品種綿羊上得出的結果一致[5，8]。

由此可見，通過增加寒泊羊群體中B基因的頻率，有望提升母羊的胎產羔數；可利用B基因作為分子標記開展寒泊羊的品種選育工作，以期提高寒泊母羊的胎產羔數及整齊度。

4 結論

BMPR-IB基因在寒泊羊種群中存在BB、B+和++3種基因類型，其基因型頻率分別為16.66%、33.34%和50.00%，B基因對胎產羔數具有正效應。