基于網絡藥理學探討六味二至加味方治療狼瘡性腎炎的作用靶點分析

夏杰 李松梅 馬殿飛

摘要： 目的 通過網絡藥理學方法，探討六味二至加味方治療狼瘡性腎炎的作用機理。方法 運用中藥系統藥理學TCMSP和ETCM數據庫篩選六味二至加味方所含有效化合物，分別運用Drugbanke、Swisstarget prediction和CTD數據庫獲取六味二至加味方的作用靶標基因和狼瘡性腎炎疾病相對應的靶標基因，將兩者取交集后得到疾病-藥物蛋白靶基因，利用STRING軟件將構建的靶基因相互作用網絡進行網絡可視化展示，經網絡結構和節點間加權重聯系的計算分析法篩選出重要的關鍵基因。結果 六味二至加味方與狼瘡性腎炎疾病靶標基因的交集基因有39個。結論 六味二至加味方治療狼瘡性腎炎是多靶點的復雜機制過程，其機制多與抗炎、免疫調節相關。

關鍵詞： 狼瘡性腎炎;六味二至加味方;網絡藥理學;作用靶點

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種自身免疫性疾病，年輕中年女性多為好發群體，以20-40歲為主[1]。SLE患者幾近均有腎臟損害，其多數表現為狼瘡性腎炎（LN），以水腫，蛋白尿，血尿為主，甚至造成腎功能衰竭和尿毒癥，LN患者生存率及生活質量不高，預后較差。中醫無與狼瘡性腎炎相應的名稱和系統論述，中醫通常認為本病病位在腎，腎虛是LN發病的內在因素[2]。孟如教授認為：狼瘡性腎炎多為內外合因所致，外因為感受邪熱，郁久成毒，進而內舍五臟六腑。基于“肝腎同源”的理論，采用滋腎養陰活血法，從肝腎論治，創制六味二至加味方。該方是孟如教授四十余年對中醫風濕免疫理論深入探討及臨床研究而形成的經驗方，臨床研究表明六味二至加味方治療LN具有顯著的臨床療效[3-4]。

目前，動物、細胞和分子實驗雖可對某一機制進行研究，但難以揭示復方中藥分子機制系統性。隨著生物信息學的迅速發展，采用多成分、多靶點的思路闡明了藥物發揮作用多層次網絡結構[5]。基于此，本文通過網絡藥理學初步挖掘中藥復方六味二至加味方治療LN的分子機制，預測潛在靶點及相關疾病信息，為開展實驗驗證提供參考依據。

1 研究方法

1.1 六味二至加味方所含化合物的收集與篩選 將六味二至加味方組成生地黃、山茱萸，山藥，茯苓，丹參等11 味中藥分別輸入中藥系統藥理學數據庫（TCMSP，ETCM）[6]，將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）設置為≥30%，類藥性指數（drug like index，DL）設置為≥0.10，查詢并篩選該數據庫中所包含的上述11味中藥的有效活性成分，ETCM中所搜集的成分保留Druglikeness Grading 為Moderate和Good。將兩個數據庫所篩選保留下來的成分，進一步根據篩選先導化合物的原則：分子質量MW在100-380之間，脂水分配系數的對數值在0-3，氫鍵供體≤5，氫鍵受體≤10，篩選出藥代動力學特性和成藥性較優的活性成分。

1.2 六味二至加味方作用靶點預測[7] 藥物分子與特定的靶點相結合，通過調節其生物活性及轉錄水平發揮作用。為了闡明藥物的作用機制，收集化合物作用靶點，對1.1中篩選的活性成分在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中進行SMILE結構式轉換后導入Swisstargetpredicti-ion（http：//www.swisstargetpredict-ion.ch）數據庫預測活性成分的靶點。

1.3 六味二至加味方有效化合物與其作用靶點相互作用的網絡構建 為了闡明六味二至加味方治療LN的制，本研究采用cytoscape3.6.0軟件[8]構建六味二至加味方活性成分-作用靶點網絡關系圖，該網絡中，化合物和靶點以節點表示，2個節點間相互作用由邊表示，每個節點的重要性通過拓撲參數度數進行評估，度數越大，說明與該節點相關的節點數越多，則該節點越重要。節點度數由Cytoscape插件Network Analyzer 進行分析。根據Degree分析結果，保留Degree≥10的靶點和成分，作為復方的核心成分和關鍵靶點。

1.4 LN發病靶點檢索及六味二至加味方作用LN相關靶點的預測[9-11] 在CTD數據庫（http：//ctdbase.org/）及Disgenet數據（https：//www.disgenet.org）中以Lupus Nephritis為關鍵詞搜索LN疾病相關靶點。本研究取兩個數據庫共有靶點進行后續分析研究。將六味二至加味方作用靶點與疾病靶點導入VENNY（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）軟件，得到交集靶點，即六味二至加味方作用LN的靶點。

1.5 六味二至加味方對LN作用靶點的PPI網絡構建 為了獲得六味二至加味方對LN作用靶點之間的聯系，將六味二至加味方對LN的靶點上傳至STRING 10.5 數據庫（https：//string-db.org）[12]，選擇研究人類物種，設置靶點之間最低要求聯系分數為0.4，并隱藏不與其他靶點聯系的靶點，得到靶點聯系網絡圖。將該圖導入Cytoscape 3.7.0軟件進行拓撲學分析并構建PPI 網絡。

2 結果與分析

2.1 六味二至加味方所含化合物的收集與篩選結果 篩選出六味二至加味方的活性化合物共108個，其中地黃有效成分1個，山茱萸16個，山藥9個，茯苓1個，澤瀉11個，牡丹皮8個，小薊3個，益母草12個，丹參33個，墨旱蓮11個，女貞子3個。

2.2 六味二至加味方有效化合物作用LN 相關靶點預測及成分靶點網絡構建結果 2.1中82個化合物共檢索出2137 個預測靶點，同時構建C-T圖，根據Degree分析結果，保留Degree≥10的靶點和成分，作為復方的核心成分和關鍵靶點，共167個，其中化合物毛地黃黃酮（網絡節點度=19），四氫鴨腳木堿（網絡節點度=19），二氫丹參內酯（網絡節點度=18），海風藤酮（網絡節點度=18），山柰酚（網絡節點度=17），異鼠李素（（網絡節點度=16），丹參新醌D（網絡節點度=13），將每個化合物與其作用的LN靶點相聯系，通過Cytoscape 3.7.0 軟件做出化合物-靶點聯系圖（見圖1）。運用軟件中自帶的NetworkAnalyzer 插件分析網絡節點度（degree）。越高的數值說明其相對應的化合物、靶點在網絡中越關鍵。表明它們是六味二至加味方治療LN的主要有效化合物和靶點。

2.3 LN相關靶點檢索及六味二至加味方作用LN 相關靶點的預測結果 通過CTD（http：//ctdbase.org/）、Disgenet（https：//www.uniprot.org/ database /DB-0218）數據庫，得分≥ 10 分的靶點共檢索出696個與LN 相關的靶點，將六味二至加味方82個有效化合物所對應的167 個預測靶點與696 個LN 相關靶點導入VENNY（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）軟件，共得到39 個共同靶點，即六味二至加味方作用LN 的靶點，見圖2。

2.4 六味二至加味方對LN 作用靶點的PPI 網絡構建結果 根據1.5 中要求，STRING10.5（https：//string-db.org）數據庫獲得39 個靶點之間共407條聯系的網絡圖。將圖導入Cytoscape 3.6.1 軟件進行拓撲學分析，獲得聯系其他靶點個數排名前6 位的靶點依次是VEGFA（36 個）、TNF（32 個）、IL6（34 個）、IL10（33 個）、STAT3（33 個）、CXCL8（32 個）。六味二至加味方對LN作用靶點的PPI 網絡圖，見圖3。

3 討論

六味二至加味方源自《金匱要略》所載之“崔氏八味丸”（仲景易名曰腎氣丸）減去桂枝、附子而成的六味地黃丸合《太平惠民和劑局方》中的二至丸化裁加味而來，二方合用滋補肝腎之功增強。此外，孟如教授指出，本病熱毒阻滯，氣滯血瘀，故在狼瘡性腎炎的治療過程中，活血化瘀法要貫穿始終。網絡藥理學基于多靶點的研究思路，為我們提供了復方中藥新的策略。本研究借助網絡藥理學手段，初步挖掘、分析六味二至加味方治療 LN 的可能作用機制。

本研究結果顯示，六味二至加味方和LN的交集靶基因共39個，進一步提煉出六味二至加味方治療LN的生物學功能。研究表明[14-18]，TNF（腫瘤壞死因子）作為自身免疫炎癥反應過程中的關鍵因子，在SLE患者的血清中，sTNFRs、TNF-α這兩項指標的表達水平均高于健康人時，SLE發病幾率增大。VEGFA（血管內皮生長因子A）能發揮誘使內皮細胞增殖、遷移及抑制凋亡的作用，研究表明，LN患者的血清中的VEGF水平明顯高于未患病對照組，推導VEGF水平很可能收到刺激而升高表達水平，從而在LN中發揮作用。mTOC在以下生化反應中起至關重要的作用：自噬、調控免疫分化、氧化應激過程及炎性因子分泌，若mTOC被阻斷，有利于LN患者病情的控制。作為抗原遞呈細胞和T細胞有效抑制因子之一IL-10，不僅能抑制單個核細胞而分泌前炎癥因子，還能抑制絲裂原誘導的T細胞增殖反應，因IL10分泌量的增加，可以相對闡明SLE疾病免疫調節的紊亂狀態。IL-6可以刺激誘導T細胞和B細胞的增殖。IL-6在CRP調節方面發揮至關重要的作用，IL-6通過與IL-R6結合，能夠促使B細胞分泌抗雙鏈DNA和IgG抗體，誘發腎小球內的炎癥反應，從而誘導系膜細胞增殖和收縮以及腎小球的血流量減少甚至加重其缺血和缺氧量，進一步損害腎小球上皮細胞和系膜細胞。 通過研究LN小鼠發現，在其腎組織中p-STAT3 蛋白和mRNA的表達水平顯著高于同等條件下無腎組織損害的對照C57BL/6小鼠;同時，通過免疫組化的結果得出，BXSB小鼠腎組織細胞核是STAT1/3表達的場所，提示STAT1/3被活化。

綜上所述，六味二至加味方可能經炎癥、細胞增殖及免疫因子信號通路等作用于LN，它是一種多個靶點的復雜的生理機制過程，本研究為闡明藥物-靶點之間相互作用機制提供了重要參考信息，同時也為中醫藥治療狼瘡性腎炎提供了作用機制研究方面的思路。

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（收稿日期：2020-03-11）