麗江山慈菇藥材鑒別方法改進

黃云先　劉云懷　楊光榮

摘要：目的對麗江山慈菇標準中鑒別方法改進。方法用顯微及專屬性強的秋水仙堿對照品TLC薄層鑒別。結果顯微鑒定作為鑒別中藥、中成藥的手段之一，其方法可變性不強、操作簡便、而特異性較強，薄層鑒別引進代表性成份秋水仙堿對照品進行定性。結論改進方法簡便、快捷，準確度高，專屬性強，重現(xiàn)性好，可用于麗江山慈菇藥材的鑒別及質量控制。

關鍵詞：麗江山慈菇;TLC薄層色譜鑒別;秋水仙堿;顯微鑒別

中圖分類號：R284.1文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2020）04-0080-04

麗江山慈菇是百合科植物山慈菇Iphigenia indica Kunth的鱗莖[7]。又名山慈菇、土貝母、草貝母、假貝母、鬧狗藥[1]、苦子、光苦子、益辟堅[3]、光慈菇[5]。云南省地方習用藥材，為納西族、白族、彝族常用藥材。載于《本草遺拾》，為《云南省藥品標準》（1974年版、1996年版）、《云南省中藥材標準》2005年版第二冊·彝族藥收載品種。與《中國藥典》（2015年版一部）收載“山慈菇”比較，來源系不同科屬植物，為與國家標準相區(qū)別，謂之“麗江山慈菇”。是云南通用善美制藥有限責任公司生產(chǎn)的“乳癖清膠囊（國藥準字Z20025068）”的原料藥之一。麗江山慈菇還是提制秋水仙堿的主要原料。《云南省中藥材標準》2005年版第二冊·彝族藥中對麗江山慈菇的鑒別對照藥材薄層色譜鑒別，本文參照文獻[6]，通過對云南省麗江古城區(qū)和玉龍縣及大理4個批次的麗江山慈菇樣品做了顯微鑒別及專屬性較強的成分秋水仙堿的薄層色譜鑒別，以建立一個專屬性更強的鑒別方法，從面達到控制麗江山慈菇藥材質量的目的。

1儀器與實驗材料

1.1儀器德國塞多利斯BT224S電子分析天平;梅特勒MS205DU電子分析天平;Purelab Flex 超純水機。

1.2實驗材料

1.2.1試藥試劑秋水仙堿（C22H25NO6）對照品適量（中國食品藥品檢定研究院，批號：101176-201202，按93.6%計）;甲苯、丙酮、甲醇、三氯甲烷、環(huán)己烷（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）;水（實驗室自制UP水，Ω=18.3）;硅膠GF254薄層板（青島海洋化工）;硅膠G薄層板（青島海洋化工）;硅膠G薄層板（美國莫克）。

1.2.2樣品來源麗江山慈菇樣品購買、采集麗江古城區(qū)、玉龍縣及大理樣品共4個。

L01，2015年8月，采自麗江市玉龍縣龍蟠鄉(xiāng)新文村;為野生品;為干燥花期全株。

L02，2015年9月，采自麗江市古城區(qū)金山鄉(xiāng)東河村;為野生品;為干燥果期全株。

L03，2015年9月，購自麗江市古城區(qū)象山市場，為大理州鶴慶縣野生品;為干燥藥材球莖。

L04，2015年10月，購自麗江市玉龍縣龍蟠鄉(xiāng)新文村藥農嚴四軍，為其采挖的當?shù)匾吧?為干燥藥材球莖。

2方法與結果

2.1顯微鑒別本品球莖橫切面：表皮細胞1列，細胞扁平，長30～60μm，厚18～23μm，外被角質層。其內側為寬廣的薄壁組織，薄壁組織中充滿淀粉粒。維管束稀疏散在，外韌型，導管3～7個，環(huán)紋或網(wǎng)紋，導管常伴2～3個纖維。（自擬方法）（見圖1）。

本品粉末類白色。淀粉粒眾多，多為單粒，呈不規(guī)則球形、類圓形或盔帽形，直徑4～35μm，少數(shù)為2～3復粒，臍點呈裂縫狀或星狀。導管環(huán)紋、螺紋或網(wǎng)紋，直徑9～45μm（自擬方法），（見圖2a-d）。

2.2薄層鑒別（原標準方法）取本品粉末2 g，加濃氨水1mL，三氯甲烷25mL，振搖，放置過夜，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1mL使溶解，作為供試品溶液。另取麗江山慈菇對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部0502）試驗，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（6：3：1）為展開劑，另取氨水置展開缸中，預飽和15 min，展開，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。再噴以改良碘化鉍鉀試液，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，（見圖3）。

2.3薄層鑒別（自擬方法）本品粉末1 g，加50%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取麗江山慈菇對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。再取秋水仙堿對照品，加甲醇制成每1 mL含秋水仙堿0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部0502）試驗，吸取上述3種溶液各5μl，分別點于同一硅膠GF254 nm薄層板上，以三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：2：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，樣品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的萃滅斑點，（見圖4）。

3分析方法驗證

3.1薄層鑒別2.3中樣品溶液制備試驗篩選方法1：取本品粉末1 g，加甲醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

方法2：取本品粉末1 g，加乙醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

方法3：取本品粉末1 g，加50%甲醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

方法4：取本品粉末1 g，加50%乙醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

方法5：取本品粉末1 g，加70%甲醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

方法6：取本品粉末1 g，加70%乙醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

通過實驗室實驗，發(fā)現(xiàn)方法3操作可行性高，分離效果良好，方法驗證效果良好，決定選用方法3為最終供試品制備方法。

3.2展開劑篩選展開劑1 三氯甲烷-丙酮-甲醇（6：3：1）

展開劑2：三氯甲烷-甲醇（10：1）

展開劑3：三氯甲烷-甲醇（10：3）

展開劑4：三氯甲烷-甲醇（19：1）

展開劑5：三氯甲烷-環(huán)己烷（10：1）

展開劑6：三氯甲烷-環(huán)己烷（10：3）

展開劑7：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（6：3：1）

展開劑8：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：1：1）

展開劑9：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：2：2）

展開劑10：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：2：1）

展開劑11：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：3：1）

通過比對用展開劑10號展開時RF值為0.37，在0.2～0.8藥典規(guī)定的范圍，展開效果好。

3.3檢視方法的選擇（1）紫外光燈（254nm）下檢視;（2）紫外光燈（365nm）下檢視;（3）噴以改良碘化鉍鉀試液顯色;（4）噴以飽和三氯化銻三氯甲烷溶液顯色。選用上述了四種方法檢視，第一法斑點清晰且方法簡便。

3.4點樣方式及點樣量考察點樣方式為接觸點樣;點樣量為2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL。溫度及相對濕度的影響 按照試驗所得薄層色譜條件，考察本品在溫度5℃～30℃、相對濕度10%～75%展開時，對薄層色譜結果的影響。結果表明，在上述溫度、濕度范圍內對該薄層色譜結果無明顯影響。

3.5預平衡試驗按照試驗所得薄層色譜條件，考察未平衡、平衡15 min、平衡30 min展開，對薄層色譜結果的影響。結果表明，平衡15 min比未平衡分離得好，平衡30 min展開時間太長。因此選用平衡15 min后展開。

3.6重復性不同產(chǎn)地的4批次樣品的檢測結果表明，該方法具有重復性。

4討論

試驗表明，采用方法3制備供試品溶液，硅膠GF254薄層板，點樣量5 μL，以展開劑15 mL為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。所得薄層色譜斑點清晰，分離較好，易判斷結果，且重現(xiàn)性好。

顯微鑒定作為鑒別中藥、中成藥的手段之一，其方法可變性不強、操作簡便、而特異性較強，可以說利用顯微特征對比鑒定對大多數(shù)中藥材都行之有效。經(jīng)實驗，麗江慈菇山也不例外，的確具有其顯著的特異性。建議標準修訂時增加顯微鑒別。

原標準中鑒別項下未引進代表性對照品進行定性定量，考慮引進仙水仙堿作為其代表性成分。經(jīng)實驗，新擬方法薄層色譜條件可行。建議標準修訂時增加現(xiàn)擬方法，應與秋水仙堿對照品及麗江山慈菇對照藥材色譜相同。可見以秋水仙堿作為麗江山慈菇藥材標識性成分有其合理性。可用于麗江山慈菇藥材的質量控制。

參考文獻：

[1]云南省藥物研究所.云南天然藥物圖鑒[M].昆明：云南科技出版社，2004：225.

[2]中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒[M].北京：科學出版社，1980：440.

[3]王國強.全國中草藥匯編（卷二）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：543.

[4]中國藥用植物志編委會編.中國藥用植物志[M].北京：北京大學醫(yī)學出版社，2014：106.

[5]有毒中草藥大辭典編輯委員會.有毒中草藥大辭典[M].天津：天津科技翻譯出版公司，1991：265.

[6]國家藥典委員會.中國藥典[S].四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[7]云南省食品藥品監(jiān)督管理局.云南省中藥材標準[S].昆明：云南出版集團公司云南科技出版社，2005：57.

（收稿日期：2019-12-23）

作者簡介：黃云先（1977-），女，本科，副主任藥師，研究方向：中藥材、中成藥及食品檢驗。