左旋紫草素對順鉑耐藥人宮頸癌HeLa細胞的逆轉作用研究

杜春雙 馬亞妮 王帥 張飛 張潔 桑廣健

摘 要 目的：探討左旋紫草素（L-SHK）對順鉑（DDP）耐藥人宮頸癌HeLa細胞（HeLa/DDP）的逆轉作用及其可能機制。方法：以人宮頸癌HeLa細胞株為研究對象，以DDP誘導獲得HeLa/DDP耐藥細胞;采用CCK-8法測定HeLa/DDP細胞的耐藥指數以及不同劑量L-SHK（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L）對該細胞的抑制率、半數抑制濃度（IC50）和逆轉倍數;采用流式細胞術檢測低、中、高劑量L-SHK（0.3、0.6、1.2 μmol/L）聯合DDP對HeLa/DDP細胞周期及凋亡率的影響，采用Western blotting法檢測低、中、高劑量L-SHK（0.3、0.6、1.2 μmol/L）聯合DDP對HeLa/DDP細胞凋亡相關蛋白[剪切型胱天蛋白酶3（Cleaved caspase-3）、Bcl-2、Bax]表達的影響。結果：所得HeLa/DDP細胞的耐藥指數為11.8。L-SHK對HeLa/DDP細胞的抑制率有隨劑量增加而逐漸升高的趨勢。與單用DDP比較，DDP+低、中、高劑量L-SHK組細胞的IC50值均顯著降低，且呈劑量依賴性（P<0.05）;DDP+低、中、高劑量L-SHK組的逆轉倍數分別為1.38、2.80、6.71。與空白對照組比較，各藥物組G0/G1期、S期細胞比例，各劑量L-SHK聯用組細胞的早期、晚期凋亡率及總凋亡率以及Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達量均顯著升高;各藥物組G2/M期細胞比例以及各劑量L-SHK聯用組Bcl-2蛋白的表達量均顯著降低（P<0.05）。與DDP組比較，各劑量L-SHK聯用組S期、G2/M期細胞比例和Bcl-2蛋白的表達量均顯著降低;G0/G1期細胞比例，早期、晚期凋亡率及總凋亡率和Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達量均顯著升高（P<0.05）。結論：HeLa/DDP細胞對DDP具有一定的耐藥性，L-SHK可逆轉這種耐藥性。L-SHK和DDP聯用可促進HeLa/DDP細胞凋亡，且作用強于DDP單用;這種作用可能與影響細胞周期、調控凋亡相關蛋白的表達有關。

關鍵詞 人宮頸癌HeLa細胞;左旋紫草素;順鉑;耐藥;凋亡;細胞周期;凋亡蛋白;逆轉作用;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the reversal effects and potential mechanism of levoshikonin（L-SHK）on cisplatin（DDP） resistance of human cervical carcinoma HeLa cells. METHODS： Human cervical carcinoma HeLa cells were used as research objects， and drug-resistant HeLa/DDP cells were induced by DDP. CCK-8 assay was used to determine drug resistance index of HeLa/DDP cells， the inhibition rate of different doses of L-SHK （0.125， 0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L） on cell proliferation， IC50 and the reversion index of L-SHK on HeLa/DDP cells. Effects of low， medium and high doses of L-SHK （0.3， 0.6， 1.2 μmol/L） combined with DDP on cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry. Western blotting assay was used to detect the effects of low， medium and high doses of L-SHK （0.3， 0.6， 1.2 μmol/L） combined with DDP on the expression of apoptosis-related protein （Cleaved caspase-3， Bcl-2 and Bax）. RESULTS： The drug resistance index of HeLa/DDP cells was 11.8. The inhibition rate of L-SHK on HeLa/DDP cells increased with the increase of dose. Compared with DDP alone， IC50 of DDP+low-dose， medium-dose and high-dose L-SHK groups were decreased significantly， with a dose-dependent manner （P<0.05）. The reversion indexes were 1.38， 2.80， 6.71 in DDP+low-dose， medium-dose and high-dose L-SHK groups. Compared with blank control group， the proportion of cells at phase G0/G1 and phase S in administration groups， as well as early and late apoptosis rate and total apoptosis rate of cells， the protein expression of Bax and Cleaved caspase-3 in L-SHK combination groups were increased significantly; the proportion of cells at phase G2/M in administration group as well as the protein expression of Bcl-2 in L-SHK combination groups were decreased significantly （P<0.05）. Compared with DDP group， the proportion of cells at phase S and G2/M and the protein expression of Bcl-2 in L-SHK combination groups were significantly decreased; the proportion of cells at phase G0/G1， early and late apoptosis rate and total apoptosis rate， the protein expression of Bax and Cleaved caspase-3 in L-SHK combination groups were significantly increased （P<0.05）. CONCLUSIONS： HeLa/DDP cells are resistant to DDP， and L-SHK can reverse the drug resistance. L-SHK combined with DDP can promote the apoptosis of HeLa/DDP cells， which is better than DDP alone. Its mechanism may be related to the influence of cell cycle and the regulation of apoptosis-related protein expression.

KEYWORDS? ?Human cervical carcinoma HeLa cells; Levoshikonin; Cisplatin; Resistance; Apoptosis; Cell cycle; Apoptosis- related protein; Reversal effect; Mechanism

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，發病率在全球女性常見惡性腫瘤中位居第3位，最新的統計顯示，全球每年新發宮頸癌56.9萬例，死亡約31.1萬例[1-2]。化療是當前治療宮頸癌的主要手段，順鉑（Cisplatin，以下簡稱“DDP”）為宮頸癌化療的一線用藥。然而，由于DDP長期應用易導致耐藥的發生，嚴重影響了宮頸癌的治療效果[3]。由此可見，DDP耐藥性問題是宮頸癌臨床治療中亟待解決的難題之一。紫草（Arnebiae Radix）為紫草科多年生草本植物新疆紫草[Arnebia ecuchroma （Royle） Johnst.]或內蒙紫草（Arnebia guttata Bunge）的干燥根，具有涼血、活血、解毒、透疹的功效，常用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等癥[4]。紫草素（Shikonin，以下簡稱“SHK”）是從紫草中分離得到的一種天然萘醌類化合物。有研究證明，該化合物可抑制多種腫瘤細胞的增殖，并可通過促進腫瘤細胞凋亡和壞死等途徑來發揮對腫瘤的治療作用[5-6]。目前有新的研究表明，SHK對部分耐藥腫瘤細胞具有一定的逆轉作用，在耐藥性卵巢癌、膠質母細胞瘤、肺癌等的治療方面表現突出[7-14]。天然提取的SHK包含左旋體和右旋體兩種旋光異構體，由于其右旋體不溶于水，故多以左旋紫草素（L-SHK）進行實驗研究。本課題組前期研究顯示，L-SHK聯合DDP能夠增強DDP對宮頸癌HeLa細胞的抑制作用[15]。基于此，本研究擬進一步研究L-SHK對DDP耐藥宮頸癌細胞（HeLa/DDP）耐藥性的影響及其可能的分子機制，以期為耐藥逆轉劑的篩選以及SHK類化合物新藥的開發奠定理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

31型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Eclipse TS100型顯微鏡、GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;Epoch 2型微孔板分光光度計（美國BioTek公司）;FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀（美國BD公司）;PowerPac型細胞電泳儀（美國Bio-Rad公司）;C-DIGIT凝膠成像儀（美國LI-COR公司）;MH1型微量振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;DK-8D型水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）;PMC-060型迷你掌上離心機（日本Tomy公司）;AC2-6S1AirstreamⅡ級A2型生物安全柜（美國SCCO公司）;AB 135-S型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

L-SHK對照品（天津一方科技有限公司，批號：AB072S，純度：>99%）;DDP注射液（江蘇豪森藥業集團有限公司，批號：601191902，規格：6 mL ∶ 30 mg）;RPMI 1640培養液、胎牛血清（美國Gibco公司，批號分別為1181753、C2027005）;含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰酶（天津百諾克醫藥生物技術科技有限公司，批號：280514）;不含ETDA的胰酶（美國Hyclone公司，批號：1715826）;膜聯蛋白Ⅴ-硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒、RNA酶A（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為C0080、R10030）;CCK-8檢測試劑（日本Dojindo公司，批號：KN709）;RIPA細胞裂解液（美國Sigma公司，批號：C0157）;兔抗人Bax、Bcl-2、剪切型胱天蛋白酶3（Cleaved caspase-3）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國ImmunoWay Biotechnology公司，批號分別為YM2631、YT0278、YC0002、YM2018）;蛋白上樣緩沖液、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G抗體（碧云天生物技術研究所，批號：P0013、A0217）;DC蛋白定量試劑盒（美國Bio-Rad公司，批號1702409）;Western blotting試驗顯影液、定影液（天津開發區宏豐科工貿有限公司）;ECl發光液由本實驗室自制;二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人宮頸癌HeLa細胞系由天津市腫瘤醫院公共實驗室提供。

2 方法

2.1 溶液的配制

稱取L-SHK對照品10 mg，溶于DMSO 1 mL中，制成濃度為34.7 μmol/L的L-SHK貯備液，置于4 ℃冰箱中保存;以DDP注射液作為DDP貯備液（5 g/L），于4 ℃冰箱中冷藏保存。

2.2 HeLa細胞及HeLa/DDP細胞的培養

2.2.1 HeLa細胞 取出凍存的HeLa細胞，在37 ℃水浴中迅速融化，以1 000 r/min離心5 min，沉淀加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液（以下簡稱“完全培養基”）1 mL，吹打均勻后接種至培養皿中，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養（培養條件下同）。觀察細胞形態及數量，待細胞長滿培養皿的80%時傳代1次，具體操作如下：吸棄培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.5）清洗1～2次，加入含EDTA的0.25%胰酶、PBS各1 mL，消化2～3 min，加入不含血清的RPMI 1640培養液終止消化，吹打制成細胞懸液，再按細胞懸液與培養液體積比1 ∶ 3進行傳代，培養，即得HeLa細胞。

2.2.2 HeLa/DDP細胞 取出凍存的HeLa細胞按照“2.2.1”項下方法復蘇后，加入完全培養基1 mL，培養，待細胞長滿培養皿的80%后按“2.2.1”項下方法傳代，待傳代細胞長至對數生長期時，將培養基更換為含DDP 100 μg/L的RPMI 1640培養液，繼續培養48 h后，棄去原培養液，更換為完全培養基繼續培養。待細胞長滿培養皿的80%后同法傳代，待傳代細胞長至對數生長期時加入DDP（質量濃度為前次培養的2倍），反復換藥培養，直至DDP質量濃度達100 mg/L（根據前期預試驗結果確定），即得HeLa/DDP細胞。

2.3 HeLa/DDP細胞耐藥指數的檢測

采用CCK-8法檢測。取“2.2”項下對數生長期的HeLa和HeLa/DDP細胞適量，以5 000個/孔接種至96孔培養板中，培養24 h后，將細胞隨機分為對照組（即DDP組）和不同劑量藥物組。對照組加入完全培養基100? ? ?μL，各藥物組加入含DDP的完全培養基100 μL（DDP的最終質量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 mg/L，劑量設置參考前期預試驗所得DDP對非耐藥細胞的作用濃度[9]），每組設3個復孔。培養48 h后，棄去培養基，每孔加入CCK-8試劑10 μL;培養2.5 h后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，在計算抑制率、半數抑制濃度（IC50）的基礎上，計算HeLa/DDP細胞的耐藥指數。抑制率=（1-試驗組細胞OD值/對照組細胞OD值）×100%;耐藥指數=藥物對耐藥細胞的IC50/藥物對敏感細胞的IC50（當耐藥指數<5時，為低度耐藥;當耐藥指數為5～15時，為中度耐藥;當耐藥指數>15時，為高度耐藥[16]）。上述試驗重復3次（下同）。

2.4 L-SHK對HeLa/DDP的增殖抑制作用及耐藥逆轉作用考察

2.4.1 L-SHK對HeLa/DDP的增殖抑制作用 采用CCK-8法檢測。取“2.2”項下對數生長期的HeLa/DDP細胞適量，以5 000個/孔接種至96孔培養板中，培養24 h后，將細胞隨機分為對照組（即DDP組）和不同劑量藥物組。對照組加入含DDP的完全培養基100 μL（DDP的最終質量濃度為2 mg/L，劑量設置參考該藥表觀分布容積及“2.3”項下試驗結果，下同），各藥物組加入同時含L-SHK和DDP的完全培養基100 μL（DDP最終質量濃度均為2 mg/L，L-SHK的最終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L;劑量設置參考前期預試驗所得L-SHK對非耐藥細胞的作用濃度[9]），每組設3個復孔。培養48 h后，棄去培養基，每孔加入CCK-8試劑10 μL;培養2.5 h后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的OD值，按“2.3”項下方法計算抑制率。

2.4.2 L-SHK對HeLa/DDP的耐藥逆轉作用 采用CCK-8法測定。取“2.2”項下對數生長期的HeLa/DDP細胞適量，以5 000個/孔接種至96孔培養板中，培養24 h后，將細胞隨機分為對照組（即DDP組）和不同劑量藥物組。對照組加入含DDP的完全培養基100 μL（DDP的最終質量濃度為2 mg/L），各藥物組分別加入同時含DDP和L-SHK的完全培養基100 μL（DDP的最終質量濃度均為2 mg/L，低、中、高劑量L-SHK的最終濃度分別為0.3、0.6、1.2 μmol/L;劑量設置參考“2.4.1”項下結果及前期試驗結果[15]，下同），每組設3個復孔。培養48 h后，棄去培養基，每孔加入CCK-8試劑10 μL;培養2.5 h后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的OD值，按“2.3”項下方法計算抑制率和IC50，并計算逆轉倍數。逆轉倍數=使用逆轉劑前藥物對細胞的IC50/使用逆轉劑后藥物對細胞的IC50。

2.5 L-SHK聯合DDP對HeLa/DDP細胞周期分布的影響考察

采用流式細胞術檢測。取“2.2”項下對數生長期的HeLa/DDP細胞適量，以5 000個/孔接種于24孔培養板中，培養24 h后，將細胞分為空白對照組、DDP組以及DDP+低、中、高劑量L-SHK組。空白對照組加入完全培養基1 mL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養基1 mL（DDP最終質量濃度均為2 mg/L，低、中、高劑量L-SHK的最終濃度分別為0.3、0.6、1.2 μmol/L），每組設3個復孔。培養48 h后，收集細胞，用4 ℃的PBS清洗2次后，置于4 ℃的70%乙醇中固定過夜;以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用預冷的PBS清洗2次，棄去上清液;每管加入PI試劑500 μL，同時加入RNA酶A使其最終質量濃度達100 μg/mL，于4 ℃染色15 min后，使用流式細胞儀測定各細胞周期的分布比例。

2.6 L-SHK聯合DDP對HeLa/DDP細胞凋亡的影響考察

采用流式細胞術檢測。取“2.2”項下對數生長期的HeLa/DDP細胞適量，以5 000個/孔接種于12孔培養板中，培養24 h后，按“2.5”項下方法分組、給藥，每組設3個復孔。培養48 h后，用不含EDTA的胰酶消化，以? ? ?1 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，以PBS洗滌2次，收集細胞。每組細胞分別加入Annexin Ⅴ-FITC結合液195 μL，輕輕重懸;再于暗室內加入Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μL，輕輕混勻;最后加入PI試劑5 μL，混勻，于室溫避光孵育10 min后，使用流式細胞儀檢測其早期、晚期凋亡率及總凋亡率。

2.7 L-SHK聯合DDP對HeLa/DDP細胞凋亡相關蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法檢測。取“2.2”項下對數生長期的HeLa/DDP細胞適量，以5 000個/孔接種于12孔培養板中，培養24 h后，按“2.5”項下方法分組、給藥，每組設3個復孔。培養48 h后，加入RIPA細胞裂解液100 μL，充分混勻，冰浴30 min，于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，以DC法測定蛋白含量。蛋白經上樣緩沖液稀釋后，于100 ℃下變性5 min。取變性后的蛋白樣品適量，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓：80～180 V）;電泳后，于80 V下轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上;以5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入相應一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗5 min×3次，加入相應二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗5 min×3次，以ECL發光液顯色處理后，置于凝膠成像儀上成像并采用Image J v1.7.0軟件分析，以相應蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示該蛋白的表達量。

2.8 統計學方法

采用SPSS 15.0軟件對數據進行統計分析。數據以x±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 HeLa/DDP耐藥細胞的耐藥指數

DDP對HeLa/DDP細胞的IC50值為（35.82±0.34）mg/L，顯著高于其對HeLa細胞的（3.04±0.43） mg/L（P<0.05）;HeLa/DDP細胞的耐藥指數為11.8，為中度耐藥。

3.2 L-SHK對HeLa/DDP細胞的抑制及耐藥逆轉作用

3.2.1 L-SHK對HeLa/DDP細胞的抑制作用 L-SHK作用后HeLa/DDP細胞的抑制率見圖1。由圖1可見，L-SHK對HeLa/DDP細胞的抑制率有隨劑量增加而逐漸升高的趨勢，其IC50為3.92 μmol/L。結合上述結果并參考本課題組前期試驗結果[15]，發現當L-SHK為0.3、0.6、1.2 μmol/L時，其對HeLa/DDP細胞的抑制作用較小，故以這3個濃度分別作為后續試驗的低、中、高劑量。

3.2.2 L-SHK對HeLa/DDP細胞的耐藥逆轉作用 L- SHK作用后HeLa/DDP細胞的IC50和逆轉指數見表1。由表1可見，與DDP組比較，DDP+低、中、高劑量L-SHK組的IC50值均顯著降低，且DDP+中、高劑量L-SHK組顯著低于DDP+低劑量L-SHK組，DDP+高劑量L-SHK組顯著低于DDP+中劑量L-SHK組（P<0.05），呈劑量依賴性;DDP+低、中、高劑量L-SHK組的逆轉倍數分別為1.38、2.80、6.71。

3.3 L-SHK聯合DDP對HeLa/DDP細胞周期的影響

與空白對照組比較，各藥物組G0/G1期、S期細胞比例均顯著升高，G2/M期細胞比例均顯著降低（P<0.05）;與DDP組比較，DDP+低、中、高劑量L-SHK組G0/G1期細胞比例均顯著升高，S期、G2/M期細胞比例均顯著降低（P<0.05），詳見圖2、表2。

3.4 L-SHK聯合DDP對HeLa/DDP細胞凋亡的影響

與空白對照組和DDP組比較，DDP+低、中、高劑量L-SHK組細胞的早期、晚期凋亡率及總凋亡率均顯著升高（P<0.05）;而DDP組上述指標與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見圖3、表3。

3.5 L-SHK聯合DDP對HeLa/DDP細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與空白對照組和DDP組比較，DDP+L-SHK聯用組細胞中Bcl-2蛋白的表達量均顯著降低，Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達量均顯著升高（P<0.05）;而DDP上述指標與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見圖4、表4。

4 討論

近年來，有關SHK類化合物的研究報道日益增多，其作為腫瘤耐藥治療的增敏劑，可一定程度上逆轉腫瘤細胞的耐藥性[9-12]，這一發現使得腫瘤治療領域的研究有了新的突破。Shilnikova K等[7]研究了L-SHK對DDP耐藥的人卵巢癌A2780細胞（A2780-CR）的毒性和遷移抑制作用，發現該化合物可增加耐藥細胞線粒體膜去極化、上調上皮細胞鈣黏蛋白表達、下調神經元鈣黏蛋白表達，從而降低A2780-CR細胞的遷移能力，抑制該細胞的上皮間質轉化。替莫唑胺（TMZ）是膠質母細胞瘤（GBM）常用的化療藥物，但其嚴重的耐藥性影響了GBM的治療效果;將SHK、TMZ聯合處理GBM細胞后，發現GBM細胞的增殖和遷移能力均有所減弱，基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9的表達均明顯下調，并可通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路來減少GBM的復發[8]。Wang Y等[11]在研究SHK抗膀胱癌的作用機制時發現，與DDP單用相比，SHK與DDP聯用對腫瘤細胞的殺傷效果更顯著，作用機制可能與SHK可逆轉膀胱癌細胞的DDP耐藥有關。有研究顯示，L-SHK可提高EGFR基因野生型非小細胞肺癌（NSCLC）患者應用厄洛替尼/吉非替尼的抗癌效果，且聯用效果優于任一藥物單用，其機制可能為通過激活活性氧（ROS）介導的內質網應激而誘導腫瘤細胞凋亡[17]。

基于上述文獻和本課題前期工作，本研究首先建立了DDP耐藥HeLa細胞模型，發現DDP對HeLa/DDP細胞的IC50值為（35.82±0.34） mg/L，顯著高于其對HeLa細胞的（3.04±0.43） mg/L;其耐藥指數為11.8，提示該細胞耐藥性為中等。本研究進一步探討了不同劑量L-SHK對HeLa/DDP細胞增殖的抑制和耐藥逆轉作用。結果顯示，不同劑量L-SHK對HeLa/DDP細胞的抑制作用有隨劑量增加而逐漸增強的趨勢;與DDP單用相比，聯用低、中、高劑量L-SHK后，其對HeLa/DDP細胞的IC50值均顯著降低，且具有劑量依賴性;其逆轉倍數分別為1.38、2.80、6.71，提示L-SHK具有一定的耐藥逆轉活性。

前期研究結果顯示，L-SHK與DDP聯用可明顯抑制HeLa細胞增殖、促進細胞凋亡[15]。在此基礎上，本研究進一步探討了L-SHK與DDP聯用對HeLa/DDP細胞周期及凋亡情況的影響。結果顯示，與空白對照組比較，各藥物組G0/G1期、S期細胞比例以及各劑量L-SHK聯用組細胞早期、晚期凋亡率及總凋亡率均顯著升高，各藥物組G2/M期細胞比例均顯著降低;且各劑量L-SHK聯用組G0/G1期細胞比例以及早期、晚期凋亡率及總凋亡率均顯著高于DDP組，S期、G2/M期細胞比例均顯著低于DDP組。這提示與單用DDP比較，聯用L-SHK可抑制細胞周期由G0/G1期向S期、G2/M期的轉換，從而促進細胞凋亡。

為進一步研究L-SHK促進HeLa/DDP細胞凋亡的可能機制，本研究采用Western blotting法檢測了凋亡相關蛋白的表達情況。促進細胞凋亡是抗腫瘤藥物發揮治療效果的重要途徑之一，且在凋亡過程中均伴有Caspase-3家族的激活;該家族激活后，Caspase-3轉變為Cleaved caspase-3，后者表達越多，則表明細胞凋亡比例越高[18]。Bcl-2和Bax是細胞凋亡的重要調節因子，其中Bcl-2發揮抗凋亡作用，而Bax發揮促凋亡作用[19]。本研究結果顯示，與空白對照組和DDP組比較，各劑量L-SHK聯用組細胞中Bcl-2蛋白的表達量均顯著降低，Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達量均顯著升高。這提示L-SHK可通過上調Bax、Cleaved caspase-3蛋白和下調Bcl-2蛋白的表達來促進耐藥細胞HeLa/DDP的凋亡，且這種作用強于DDP單用，與許靜等[20]的研究結果基本一致。

綜上所述，L-SHK聯合DDP可逆轉卵巢癌細胞HeLa/DDP的耐藥性，其作用可能是通過影響細胞周期、調控凋亡相關蛋白的表達來實現的。但本研究并未對具體的作用機制以及其他相關因子（如P-糖蛋白、信號轉導及轉錄激活蛋白1、M2型丙酮酸激酶等）進行探討，故有待后續研究進一步完善。

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（收稿日期：2020-01-07 修回日期：2020-05-11）

（編輯：張元媛）