下調TMEM97對卵巢癌細胞SKOV3增殖、凋亡的影響及其相關機制探討

劉晉芳，徐小燕，周儒奎，徐慧超，高艷，苗宇船△

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，發病率較高［1］。全球每年約40 萬女性因卵巢癌死亡，因其發病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者就診時已屬晚期且難以治愈，5年生存率僅50%［2］。隨著分子生物學技術的不斷進步，針對卵巢癌細胞增殖、凋亡、細胞周期、浸潤、遷徙、血管生長等分子生物靶點提出的靶向治療成為卵巢癌診斷治療的重點和熱點［3］。跨膜蛋白97（transmembrane protein 97，TMEM97）又名腦膜瘤相關蛋白或MAC30，由Murphy等1993年在分析腦膜瘤相關蛋白表達差異時發現并提出［4］。研究表明TMEM97 mRNA及蛋白在人類多種腫瘤中表達水平不同，在胰腺癌和腎癌中表達量較低，在卵巢癌、食管癌、胃癌和結腸癌中表達較高［5］。但目前關于TMEM97在卵巢癌發生發展中的具體作用鮮有報道。本文檢測了下調TMEM97后卵巢癌細胞SKOV3的增殖、凋亡能力及其相關因子表達的變化，以期為卵巢癌的早期診斷及治療提供理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗所用卵巢癌細胞株SKOV3購自中國科學院上海細胞培養中心。RPMI 1640 培養基購于Hyclone 公司，雙抗、胎牛血清、CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑、細胞周期檢測試劑盒、胰酶、BCA試劑盒購自中國南京凱基生物公司。TMEM97 siRNA、陰性對照siRNA 均由中國廣州銳博生物科技有限公司合成。Opti-MEM 培養基、Lipo3000、Trizol、實時熒光定量PCR（qPCR）相關試劑、HRP標記的山羊抗兔IgG 均購自中國北京索萊寶科技公司；TMEM97、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白質（Bax）、P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38 MAPK）通路相關蛋白（P38/MAPK、p-P38/MAPK）抗體均購自美國Sigma 公司；β-actin 抗體購自美國Abcam公司。qPCR儀均購自德國Biometra公司；電泳儀和凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad 公司；多功能酶標儀購自美國Thermo Scientific 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 卵巢癌細胞系SKOV3 用含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的環境下培養，當細胞融合度達到80%時傳代。將卵巢癌細胞SKOV3分為轉染組（si-TMEM97組）、陰性對照組（siNC組）和空白對照組（Control組），前兩組均于細胞融合度達60%時進行轉染，Control組不作處理。si-TMEM97組細胞轉染濃度為100 nmol/L 的siRNA-TMEM97（si-TMEM97）。干擾序列：上游 5′-GAAGCUGCUGCUAAAGCAUUU-3′，下游 5′-AUGCUUUAGCAGCAGCUUCUU-3′。siNC 組細胞轉染相應濃度的陰性空白無意義的siRNA（siNC），干擾序列：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ ，下 游 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。按照試劑說明書要求，將Opti-MEM培養基、si-RNA、Lipo3000混合物加入不含血清的RPMI1640培養基中，6 h后更換10%的胎牛血清培養基。

1.2.2 qPCR檢測TMEM97的mRNA表達變化 SKOV3細胞轉染siRNA-TMEM97 48 h后，用Trizol提取SKOV3細胞中的總RNA，將1 μg總RNA加入20 μL混合反應體系中進行反轉錄。PCR 擴增的寡核苷酸引物：TMEM97 上游5′-ACTGCTCAGAACCCACGTCT-3′，下 游 5′-ATCATGCCACTGCCCTTTAC-3′；β-actin 上游 5′-GGAAATCGTGCGTGACATTA-3′，下游 5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′。PCR 反應體系的擴增條件：94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環40 次。按照qPCR 檢測試劑盒說明書進行實驗，整個操作注意避光，并在冰上進行。PCR 擴增反應結束后得到擴增曲線和 Ct 值，結果用 2-ΔΔCt值表示。ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。以上實驗均重復3次。

1.2.3 Western blot 檢測TMEM97、Bcl-2、Bax、P38/MAPK、p-P38/MAPK 的表達變化 SKOV3 細胞轉染siRNA-TMEM97 72 h 后，BCA 試劑盒提取SKOV3 細胞總蛋白，并測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠并轉膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃冰箱孵育過夜（TMEM97 一抗稀釋比例為1∶2 500；Bcl-2、Bax、p-P38/MAPK、P38/MAPK 一抗稀釋比例均為1∶2 000；β-actin 一抗稀釋比例為1∶1 000），PBS洗膜，二抗（1∶1 000）進行室溫孵育，用ECL發光試劑顯影。使用Image J軟件分析條帶的灰度值。以上實驗均重復3次。

1.2.4 細胞增殖能力檢測 使用CCK-8 試劑盒觀察下調基因TMEM97對細胞增殖的影響。將SKOV3細胞接種到96孔板中，24 h后換100 μL新鮮培養基。siRNA-TMEM97或陰性對照siRNA以100 nmol/L的濃度轉染細胞。分別于轉染后的0、24、48、72 和 96 h 向細胞培養液中加入 10 μL 的 CCK-8 溶液，再孵育2 h，在450 nm處檢測光密度（OD）值，計算細胞活力。以上實驗均重復3次。

1.2.5 細胞周期檢測 收集處于對數生長期的卵巢癌細胞SKOV3 懸液，調整細胞密度為1.5×105個/mL，鋪于6 孔板中，每孔2 mL。siRNA-TMEM97或陰性對照siRNA以100 nmol/L的濃度轉染細胞。48 h后離心，收集細胞，棄上清，PBS 清洗3次，并用預冷的70%乙醇在4 ℃固定過夜，再離心并收集細胞，清洗重懸之后，加入50 mg/L RNA酶和100 mg/L PI染液，300 目濾網過濾后，流式細胞儀檢測SKOV3 細胞周期的變化。以上實驗均重復3次。

1.2.6 細胞凋亡檢測 將SKOV3 細胞接種至12 孔板中，siRNA-TMEM97或陰性對照siRNA以100 nmol/L的濃度轉染細胞。48 h后收集細胞，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，使用流式細胞術檢測細胞凋亡的變化。以上實驗均重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA-TMEM97 轉染后TMEM97 基因和蛋白的表達變化 qPCR 和Western blot 檢測結果顯示，si-TMEM97 組能夠明顯抑制TMEM97 mRNA 的表達，且TMEM97 的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），而Control組和siNC組中TMEM97 mRNA和蛋白水平差異均無統計學意義，見圖1、表1。

Fig.1 Expressions of TMEM97 after transfection in SKOV3 cells圖1 轉染后TMEM97在SKOV3細胞中的表達

Tab.1 Relative expression levels of TMEM97 after transfection in three groups表1 3組轉染后TMEM97 mRNA和蛋白的相對表達量（n=3，）

Tab.1 Relative expression levels of TMEM97 after transfection in three groups表1 3組轉染后TMEM97 mRNA和蛋白的相對表達量（n=3，）

＊＊P＜0.01；a 與 Control 組比較，b 與 siNC 組比較，P＜0.01；表2、3同

組別Control組siNC組si-TMEM97組F TMEM97 mRNA 1.03±0.02 0.95±0.07 0.48±0.04ab 115.232＊＊TMEM97蛋白0.98±0.03 0.88±0.02 0.35±0.05ab 294.160＊＊

2.2 siRNA-TMEM97 轉染后SKOV3 的增殖能力變化 CCK-8檢測結果顯示，相比于Control 組和siNC組，si-TMEM97組24、48、72和96 h細胞活力顯著下降（P＜0.01），而Control 組和siNC 組間細胞活力變化差異無統計學意義，下調TMEM97 的表達能明顯抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖能力，見表2。

2.3 siRNA-TMEM97 轉染后對SKOV3 細胞周期的影響 細胞周期分析結果顯示，相比于Control 組和siNC 組，si-TMEM97 組G1 期的細胞比例減少（P＜0.01），而G2/M期的細胞比例明顯增加（P＜0.01），細胞周期阻滯于G2/M 期，下調TMEM97 的表達對SKOV3細胞具有細胞周期的阻滯效應，見圖2、表3。

Tab.2 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the proliferation of SKOV3 cells表2 轉染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細胞增殖能力的影響 （n=3，OD值，）

Tab.2 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the proliferation of SKOV3 cells表2 轉染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細胞增殖能力的影響 （n=3，OD值，）

組別Control組siNC組si-TMEM97組F 24 h 0.50±0.03 0.40±0.05 0.27±0.03ab 27.841＊＊48 h 1.05±0.02 0.94±0.02 0.48±0.04ab 342.948＊＊72 h 1.46±0.08 1.19±0.03 0.54±0.07ab 165.215＊＊96 h 1.58±0.02 1.46±0.06 0.68±0.05ab 286.130＊＊

Tab.3 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on cell cycle distribution in SKOV3 cells表3 轉染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細胞周期的影響 （n=3，%，）

Tab.3 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on cell cycle distribution in SKOV3 cells表3 轉染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細胞周期的影響 （n=3，%，）

組別Control組siNC組si-TMEM97組F G1 66.37±0.85 69.43±0.72 56.27±0.45ab 295.713＊＊S 21.33±1.21 19.81±0.64 18.71±0.23 8.085 G2/M 9.76±1.72 9.23±0.65 22.36±0.28ab 143.750＊＊

2.4 siRNA-TMEM97 轉染后對SKOV3 細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，si-TMEM97 組細胞的早期凋亡率相比Control 組和siNC 組顯著增高（P＜0.01），而Control組和siNC組細胞的早期凋亡率差異無統計學意義，下調TMEM97 的表達能夠明顯促進SKOV3細胞的凋亡，見圖3、表4。

Fig.3 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the apoptosis of SKOV3 cells圖3 轉染siRNA-TMEM97對SKOV3細胞凋亡的影響

2.5 siRNA-TMEM97 轉染對SKOV3 細胞中凋亡及P38/MAPK 通路相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，si-TMEM97 組細胞中Bcl-2 蛋白相對表達量較Control組和siNC組降低（P＜0.01），Bax和p-P38/MAPK蛋白相對表達量高于Control組和siNC組（P＜0.05），3 組細胞中P38/MAPK 蛋白相對表達量差異無統計學意義，見圖4、表4。

3 討論

Fig.4 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the expressions of Bcl-2,Bax,p-P38/MAPK and P38/MAPK in SKOV3 cells圖4 轉染siRNA-TMEM97對SKOV3細胞中Bcl-2、Bax和p-P38/MAPK和P38/MAPK表達的影響

3.1 TMEM97 與卵巢癌 卵巢癌作為女性生殖系統致死率較高的惡性腫瘤，發病隱匿，通常局限于腹腔。目前常用的治療方法是手術聯合化療，但仍有70%～80%的復發率［6］，因此探尋有效實用的卵巢癌分子治療的新靶點、新方向迫在眉睫。TMEM97 是一種跨膜蛋白成分，其在正常結腸、胃、食管的黏膜細胞以及胰腺的腺泡腺管等組織中均有表達，但TMEM97 mRNA及蛋白在人類多種腫瘤中表達量有所差異［7］。有研究報道TMEM97在惡性腫瘤中的表達量與腫瘤發生的部位及侵襲浸潤轉移程度有關，在癌細胞與腫瘤基質相互作用的過程中發揮著重要作用［8］。因此筆者推測TMEM97 可能在包括卵巢癌在內的多種腫瘤的發生和發展中發揮了重要作用。

本研究采用CCK-8 法檢測轉染后細胞的增殖能力，結果表明下調TMEM97 后卵巢癌細胞SKOV3在 24、48、72 和 96 h 的增殖活力顯著低于 Control 組和siNC 組。為了進一步證實TMEM97 對卵巢癌細胞惡性生物學特性的影響，采用流式細胞術檢測了下調TMEM97 的表達對SKOV3 細胞細胞周期及其凋亡的影響。結果顯示，與Control 組和siNC 組相比，TMEM97 沉默后對SKOV3 細胞具有周期阻滯效應，SKOV3細胞的細胞凋亡率有所增加。以上結果均表明，TMEM97 作為有效分子靶點之一參與了卵巢癌細胞SKOV3的增殖和凋亡過程。

Tab.4 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the apoptosis and signal pathway of SKOV3 cells表4 轉染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細胞凋亡及相關信號通路的影響 （n=3，）

Tab.4 Effects of siRNA-TMEM97 transfection on the apoptosis and signal pathway of SKOV3 cells表4 轉染siRNA-TMEM97對3組SKOV3細胞凋亡及相關信號通路的影響 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與siNC組比較，P＜0.05

組別Control組siNC組si-TMEM97組F凋亡率（%）2.87±0.60 2.72±0.41 5.89±0.23ab 46.550＊＊凋亡相關蛋白Bcl-2 0.96±0.01 0.87±0.12 0.46±0.03ab 36.014＊＊Bax 0.72±0.06 0.69±0.04 1.38±0.45ab 6.591＊P38/MAPK通路相關蛋白p-P38/MAPK 0.63±0.04 0.52±0.38 1.08±0.02ab 5.412＊P38/MAPK 0.91±0.06 0.82±0.03 0.87±0.05 2.871

3.2 TMEM97 與凋亡相關蛋白 本研究結果表明，TMEM97與卵巢癌細胞SKOV3的凋亡存在明顯調控關系，因此通過Western blot檢測了Bcl-2和Bax的蛋白表達水平。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族中最多見的類凋亡相關蛋白［9］。有研究報道，Bcl-2家族蛋白可通過與線粒體及凋亡家族其他蛋白相互作用等途徑影響細胞凋亡［10］。位于細胞基質中的Bax蛋白在內源性細胞凋亡途徑可加速細胞色素C的釋放，從而導致內源性凋亡的瀑布式啟動［11］。也有研究表明，p53腫瘤抑制因子的突變可以造成BH3結構域中蛋白信號傳導受損，從而導致Bcl-2過表達，抑制細胞凋亡［12］。本研究中，抑制TMEM97表達后SKOV3凋亡明顯增加，Bcl-2表達水平下降，而Bax表達水平增高，提示在卵巢癌中下調TMEM97基因可能通過抑制Bcl-2、升高Bax蛋白表達來誘導細胞凋亡。這與Song等［13］在乳腺癌中的研究結果一致，該研究表明下調TMEM97能誘導乳腺癌細胞發生凋亡。

3.3 TMEM97 與 P38/MAPK 信號傳導通路 MAPK家族是一組重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與了多種腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥反應等［14］。本研究結果提示，si-TMEM97組卵巢癌SKOV3細胞中p-P38/MAPK 相對表達量高于 Control 組和 siNC 組，表明TMEM97對卵巢癌細胞增殖和凋亡的作用可能是通過調節P38/MAPK信號通路的活性實現的。也有研究表明，P38/MAPK 通路與卵巢癌的關聯較多，如WASP 家族富含脯氨酸同源蛋白3（WAVE3）、野生型p53 誘導的磷酸酶1（WIP1）等癌基因，均可通過作用于P38/MAPK信號傳導通路調節卵巢癌細胞的增殖、凋亡、遷移等惡性生物學表型［15］。為進一步驗證TMEM97對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響是否通過調節P38/MAPK 信號通路的活性實現，今后實驗中將在信號通路中加入抑制劑來進行反證。

綜上所述，下調TMEM97 表達后卵巢癌細胞增殖能力降低、凋亡增加，其機制可能與調節Bcl-2/Bax表達及P38/MAPK信號通路的激活有關，這有望為卵巢癌的臨床治療提供新靶點和新思路。但本研究沒有涉及動物實驗，并不確定在體內下調TMEM97 表達后對卵巢癌的調節作用，因此有待今后進行更深入的機制研究。