MCP-1參與纈沙坦對阿霉素心臟毒性的預保護作用

胡丹，肖何柳 ，于勤

阿霉素（doxorubicin，Dox）屬于蒽環類藥物，是治療乳腺癌、消化道腫瘤廣譜、有效的一線化療用藥，但存在心臟毒性。研究表明Dox 累積劑量達400 mg/m2時，心力衰竭的發生率約5%，而累積劑量達550 mg/m2時，心力衰竭發生率高達17%［1］。其機制主要是由于蒽環類藥物螯合鐵離子后引起過氧化氫（H2O2）及超氧陰離子（O2-）的形成，導致心肌細胞膜脂質的過氧化，引起心肌損傷［2］。有研究發現AT1受 體 阻 滯 劑（angiotensin Ⅱ receptor antagonists，ARBs）纈沙坦對蒽環類藥物的心臟毒性具有潛在的保 護 作用［3］。單核 細 胞趨化蛋 白 -1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）在心血管疾病的發生與發展過程中發揮著重要作用，但相關信號通路在其中的作用不清楚。基于此，本研究通過阿霉素誘導建立SD大鼠心肌損傷模型，探討阿霉素誘導心肌損傷的免疫與細胞因子影響機制，觀察免疫失調是否參與阿霉素誘導的心肌損傷，并為下一步的預防與干預提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 8 周齡雄性SPF 級 SD 大鼠30 只，體質量（180.2±10.3）g，購自大連醫科大學SPF 級實驗動物中心。動物飼養于大連大學附屬中山醫院層流級動物實驗中心（室溫21～25 ℃，濕度45%～55%），給予光照14 h，黑夜10 h，固體顆粒飼料喂養。阿霉素（浙江海正藥業股份有限公司），以生理鹽水配制成終濃度為2 g/L的注射液；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司），以生理鹽水配制成終濃度為10 g/L；氯胺酮（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）；5%硫化鈉溶液（成都科龍化工有限公司）；2.5%戊二醛溶液、1%鍔酸溶液（上海生工生物工程股份有限公司）；MCP-1、調節激活正常T細胞表達和分泌因子（RANTES）、次級淋巴組織趨化因子（6Ckine）蛋白芯片檢測試劑盒（美國R&D公司）；MCP-1抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（英國Abcam 公司）。彩色超聲診斷儀（GE LOGIQ P6）、超聲探頭（GE 11L）、臺式低溫高速離心機（德國Heraeus Biofuge Stratos）；37 ℃恒溫箱、透射電鏡（日本JEDL公司），蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 30 只大鼠編號后按照隨機數字表法分為3 組，對照組（Con 組）、阿霉素組（Dox 組）和纈沙坦+阿霉素組（Val+Dox 組），每組10 只。Dox 組以1.25 mL/kg體質量腹腔注射阿霉素，1 次/周，連續6 周，生理鹽水（2 mL/kg體質量）每天灌胃1次；Val+Dox組：在Dox組給藥基礎上給予纈沙坦溶液（2 mL/kg 體質量）灌胃，每周均根據體質量重新調整藥物；Con組均以生理鹽水灌胃和腹腔注射，給藥劑量同前。本實驗方案經過大連大學附屬中山醫院倫理委員會討論通過（批準號：20180926）。

1.2.2 超聲心動圖檢測心功能變化 觀察至第10周，氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，5%硫化鈉溶液脫毛，固定大鼠。采用GE LOGIQ P6 彩色超聲儀（12.0 MHz 高頻探頭）選擇胸骨左緣左室長軸切面M 型超聲，測量左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）及左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF），連續測定4個心動周期，取平均值。

1.2.3 蛋白芯片技術檢測MCP-1、RANTES 及6Ckine 表達 采集3組大鼠下腔靜脈血2 mL，1 000 r/min離心10 min，分離血清后利用蛋白芯片技術檢測MCP-1、RANTES、6Ckine。從-80 ℃冰箱取出芯片，在室溫下靜置3 h 后編號。每個檢測單元取50～200 μL血清樣品，用2倍體積的U9緩沖液稀釋后上樣；4 ℃孵育過夜后清洗液洗膜3次；加入芯片二抗室溫避光孵育60 min；清洗液清洗和干燥后，每孔加入1 mL 顯色劑后化學發光成像。成像后將對應GAL 文件打開，使芯片圖像與GAL文件的每個陣列對齊后讀取并保存數據。

1.2.4 電鏡下觀察心肌組織病理變化 第10周處死大鼠后，取心臟，PBS 溶液沖洗3 遍，濾紙吸干稱質量，留取大鼠左心室中段心肌組織，切成約1 mm×1 mm×1 mm 組織塊，以2.5%戊二醛溶液固定，置于4 ℃冰箱保存1周，送電鏡室檢測。左心室心尖及心房組織放入-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測。

1.2.5 Western blot 檢測MCP-1 蛋白表達 取適量心肌組織，研磨后加入裂解液制勻漿，置于冰上30 min，將勻漿移至離心管中，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清。BCA 法蛋白定量后利用5%濃縮膠和15%分離膠進行SDS-PAGE電泳（每孔上樣35 μg蛋白）。電泳結束后恒流150 mA×45 min將目的蛋白轉移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入MCP-1 一抗（1∶1 000）孵育1.5 h，洗膜后再加入稀釋的二抗（1∶3 000）室溫1 h后染色，用相同方法檢測內參GAPDH蛋白表達，以MCP-1/GAPDH作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 應用SPSS 20.0 進行統計分析，符合正態分布的計量資料使用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠心功能變化 與Con組相比，Dox組和Val+Dox 組 LVEF、LVFS 明顯降低，LVESD、LVEDD明顯升高（P＜0.05）。與 Dox 組相比，Val+Dox 組LVEF、LVFS明顯升高，LVESD、LVEDD明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

Fig.1 Heart echocardiography in three groups of rats圖1 3組大鼠心臟超聲心動圖

Tab.1 Comparison of the echocardiographic measurements between three groups of rats表1 3組大鼠心功能指標比較 （n=10，）

Tab.1 Comparison of the echocardiographic measurements between three groups of rats表1 3組大鼠心功能指標比較 （n=10，）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與Dox比較，P＜0.05；表2同

組別Con組Dox組Val+Dox組F LVEF 0.94±0.02 0.65±0.03a 0.78±0.04ab 217.157＊＊LVFS（%）75.75±3.01 42.60±5.95a 53.12±4.58ab 119.003＊＊LVESD（mm）1.19±0.27 3.42±0.54a 3.01±0.37ab 81.064＊＊LVEDD（mm）3.81±0.18 5.36±0.67a 4.91±0.28ab 31.771＊＊

2.2 3 組大鼠血清 MCP-1、RANTES 和 6Ckine 變化 與 Con 組相比，Dox 組 MCP-1、RANTES 表達升高（P＜0.05），分別上調約1.87倍、1.40倍和1.26倍；與 Dox 組相比，Val+Dox 組 MCP-1、RANTES、6Ckine表達顯著下降（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the MCP-1,RANTES and 6Ckine expression levels between the three groups表2 3組MCP-1、RANTES和6Ckine表達水平比較（n=10，）

Tab.2 Comparison of the MCP-1,RANTES and 6Ckine expression levels between the three groups表2 3組MCP-1、RANTES和6Ckine表達水平比較（n=10，）

組別Con組Dox組Val+Dox組F MCP-1 9 241.49±325.21 17 250.41±265.88a 11 018.54±407.50ab 670.433＊＊RANTES 7 715.50±287.36 10 825.56±286.29a 9 463.56±255.23ab 191.964＊＊6Ckine 11 137.27±417.66 14 105.47±611.16a 11 499.24±385.01b 814.841＊＊

2.3 3 組大鼠心肌超微結構變化 透射電鏡下Con組大鼠心肌中未見自噬體，心肌細胞結構清晰，線粒體基質致密，無水腫；肌原纖維排列整齊均勻，肌節結構完整。Dox組大鼠心肌可見較豐富的呈現雙層膜的自噬小體（黑色箭頭示），心肌結構模糊，心肌纖維溶解，線粒體豐富但結構顯示不清。Val+Dox 組大鼠心肌組織中的自噬小體減少，肌原纖維結構模糊不清，排列紊亂，與Con 組相比線粒體體積增大、增多，大小不等，但結構完整。見圖2。

2.4 3 組大鼠心肌MCP-1 表達變化 與Con 組相比，Dox組MCP-1蛋白表達升高（P＜0.05）；與Dox組相比，Val+Dox 組MCP-1 蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

Fig.2 Ultrastructure findings of myocardial tissues in three groups of rats(×15 000)圖2 3組大鼠電鏡下心肌組織超微結構變化（×15 000）

Fig.3 MCP-1 protein expressions in cardiac myocytes of the three groups detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測3組心肌細胞MCP-1蛋白表達

Dox 作為臨床上治療惡性腫瘤的一線化療藥物和基礎藥物，因其嚴重的心臟不良反應而應用受限［3-5］。臨床上常規化療劑量可導致不可逆的心肌損害，心血管并發癥也是目前癌癥患者死亡的主要原因［6-7］。本課題組前期研究發現ARBs對蒽環類藥物化療導致的心臟毒性具有潛在保護作用，可以逆轉心室和血管壁重構，促進心臟功能恢復，保護心肌細胞［8］。本研究中超聲心動圖檢查顯示Dox 組LVEF 及 LVFS 較 Con 組 均 顯 著 降 低 ，LVEDD 及LVESD 均較 Con 組顯著升高，提示 Dox 處理后 SD 大鼠左室收縮功能下降，結合相應電鏡下的心肌改變，表明大鼠心力衰竭模型造模成功。Dox誘導的心肌損傷類似擴張型心肌病，導致收縮功能減退。而預防性應用纈沙坦后LVEF、LVFS較Dox組增大，LVEDD及LVESD 較Dox 組減小，表明預防性纈沙坦干預可有效減輕左心室收縮功能減退及病理性心室重塑。

心血管疾病的發生與發展過程中，炎性因子的參與發揮了重要的作用。MCP-1 屬于CC 亞族類炎癥趨化因子家族中的主要成員，其在人體多種組織細胞中均有表達。MCP-1 可減少并延遲巨噬細胞浸潤，減少細胞因子的產生，減輕心臟重塑。有證據表明，MCP-1的短期表達可能有益于心臟功能的恢復［9］。在體外實驗中，MCP-1 可保護新生小鼠心肌細胞免受缺氧誘導的凋亡［10］；相反，過表達MCP-1的轉基因小鼠慢性炎癥可引起MCP-1 的持續高表達。隨著模型動物的衰老，MCP-1升高水平更加明顯，左室質量和心室功能障礙加重［11］。上述實驗結果表明，MCP-1 在低劑量，短時間干預情況下可以在心臟修復中表現出保護性，但這種保護作用可能是由于MCP-1 誘導了保護性內質網（ER）應激伴侶的產生［12］，長期暴露于 MCP-1 引起的持續 ER 應激下，保護作用會減弱，導致心血管疾病的發生。本研究發現Dox 誘導的大鼠血清中MCP-1 蛋白顯著升高，大于蛋白組學公認的1.5 倍表達差異標準值［13］，而RANTES、6Ckine 未達1.5倍標準值。進一步檢測心肌中MCP-1 蛋白表達發現與血清檢測結果一致，提示MCP-1 廣泛參與了Dox 誘導大鼠的心肌毒性。本實驗中，Val+Dox 組 MCP-1 表達較 Dox 組顯著減少。筆者前期研究發現Dox 可使大鼠體內血管緊張素（Ang）Ⅱ顯著增加［14］。此外，體內、外實驗顯示，AngⅡ可誘導MCP-1 表達增加［15］。由于纈沙坦能選擇性作用于心臟AT1受體，使AngⅡ表達減少，筆者推測纈沙坦可能通過抑制Dox 誘導的AngⅡ升高所引起的MCP-1 表達增加，進而減輕Dox的心臟毒性。

綜上所示，本研究從心臟超聲結構、心肌超微結構和MCP-1的表達變化等方面觀察了Dox誘導心肌損傷的病理生理改變。纈沙坦可以減少心肌MCP-1 炎性因子的表達，從而預防性保護阿霉素所致心肌損傷，提示免疫失調可能參與阿霉素心肌毒性作用，本研究進一步為纈沙坦減輕阿霉素心肌損傷提供了潛在機制和解釋。