養殖實訓場常見病原菌調查

張業懷

（廣西農業職業技術學院，南寧530007）

細菌在自然界分布極為廣泛，存在于土壤、水、空氣、動物的體表及其與外界自然環境相通的腔道內，這些細菌大部分對動物生長是有益的，但也有一部分是病原菌或條件性致病菌，對動物有致病性。細菌的存活時間受到外界環境中包括溫度、濕度、光照、營養物質、酸堿度及細菌之間的相互作用等各種因素的影響，不同的細菌因其結構與生物學特性不相同而對外界環境的適應能力也不一樣，導致不同的環境中存在的細菌種類也不同。

近年來，高職院校養殖實訓場引進、飼養動物的種類及數量隨著畜牧獸醫專業招生規模的擴大而不斷增加，由此造成周圍環境細菌數量和種類也發生相應的變化，病原菌及一些條件性致病菌在一定條件下導致動物發病的現象時有發生，不僅影響動物的生長，而且也威脅著師生的安全。為此，本課題組開展養殖實訓場環境常見病原菌種類和數量的調查，以全面掌握養殖實訓場周圍環境的細菌污染現狀及致病菌的種類，為養殖實訓場衛生消毒及飼養管理制度的制定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采集廣西農業職業技術學院養殖實訓場動物欄舍中的空氣、欄舍排污水及近處的池水、欄舍周邊土壤的樣品。

1.2 培養基及試劑

普通瓊脂培養基、葡萄糖血清瓊脂培養基、蛋白胨肉湯培養基、兔新鮮血漿及3% H2O2溶液均由本實驗室提供。厭氧肉肝湯培養基、硝酸鹽培養基、牛奶培養基、SS瓊脂、血平板、TCBS瓊脂、三糖鐵瓊脂培養基、M.S.P培養基、蛋白胨酵母膏平板、剛果紅培養基、BS瓊脂、HE瓊脂、肝湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍培養基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂培養基、沙門氏菌顯色培養基、甘露醇卵黃多粘素（MYP）平板及生化鑒定所用各種細菌微量發酵管、氧化酶試驗試劑及硝酸鹽還原試驗試劑等均購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

小白鼠（約16g）均購自廣西中醫藥大學。

1.4 采樣時間

2019年3～5月，每種樣本采集4次，每次每種樣本分3個采樣點，采樣時間均為10:00～11:30。

1.5 采樣方法

1.5.1 空氣樣本采用平皿沉降法將普通瓊脂培養基平板分別放置于動物欄舍內室中央、料槽邊及走道處30min后取出，37℃培養24h[1]。

1.5.2 水樣本取動物欄舍近處的池塘水，沖洗欄舍排污水。池塘水從水深約5cm處用滅菌的三角瓶分3個點取水，而欄舍排污水直接用滅菌平皿分3個點取，最后混在一起，置實驗室冰箱4℃保存，待檢。

1.5.3 土壤樣本在動物欄舍圍墻外200cm有裸露土壤處取3個有代表性的點，先挖去表土，取深5cm左右的土壤約50g，并且3個點取樣量一樣，分別置于已滅菌的三角瓶中，置實驗室冰箱4℃保存，待檢。

1.6 樣本處理

空氣樣本直接放入37℃培養箱培養24h。而水樣本和土壤樣本都需要預稀釋處理。對水樣本，吸取1mL水樣加入到裝有9mL滅菌生理鹽水試管中，混勻，按倍比稀釋法依次稀釋成10－2～10－6濃度水樣懸液，取最后3個稀釋度各1mL放入滅菌平皿中，倒入預先滅菌冷卻到45℃普通瓊脂培養基，混勻，每個稀釋度做2個平皿，37℃培養48h。對土壤樣本，則加入滅菌生理鹽水稀釋到250mL，搖勻，靜置5min，無菌吸取5μL懸液分別接種于血平板、SS平板、麥康凱平板及普通瓊脂平板，每種平板2個，一個放入厭氧環境，并與另一個同置于37℃培養箱培養48h。

1.7 細菌分離培養

1.7.1 細菌的分離與純化接種樣本經過37℃培養24～48h后，挑取典型單個菌落進行涂片，革蘭氏染色、鏡檢。再挑取可疑菌株單菌落進行純化培養，分別接種血平板、肉湯培養基及相應的鑒別培養基，進行培養鑒定。

1.7.2 分離菌株生化鑒定對從3類樣本中分離出的14種菌株進行生化鑒定，結果具體見表1。

1.8 細菌鑒定

根據革蘭氏染色鑒定結果、鑒別培養基上的菌落培養特征及生化試驗鑒定結果對分離菌株進行鑒定[2]。鑒定細菌參照文獻[3，4]。

1.9 動物致病性試驗

對從環境中分離獲得的61株菌株（具體見表2），按常規報道的方法進行小白鼠致病性實驗[5]。

將61株分離菌分別接種肉湯培養基，根據不同菌株的培養條件進行培養，然后用滅菌生理鹽水稀釋，用細菌平板計數法測定并稀釋成含菌量為106CFU/mL的新鮮肉湯菌懸液，接種量為0.5mL/只、每株細菌做3個重復。葡萄球菌菌液采用腹部皮下注射，對照組腹腔注射等量的滅菌生理鹽水；產氣莢膜梭菌菌液采用尾靜脈注射，對照組尾靜脈注射滅菌生理鹽水，10min后全部處死，立即放入37℃恒溫箱中培養8～12h[6]；破傷風桿菌要先將分離菌株接種到厭氧肉肝湯培養基，37℃培養箱中培養48h，然后采用后腿肌肉注射，對照組注射滅菌生理鹽水；其余的分離菌液全部采用腹腔注射，對照組注射滅菌生理鹽水。

接種后觀察小白鼠活動變化及發病死亡情況，并對死亡的小白鼠進行剖檢，觀察各臟器病變，同時取病變部組織涂片及染色鏡檢并分離鑒定細菌，若結果與注入細菌相同，則判定為病原菌。未發病的繼續觀察飼養至兩周。

表1 可疑菌株生化試驗及鑒別培養情況

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定結果

整個試驗共采集4批樣品，空氣樣本、水樣本及土壤樣本各12份，共分離出61株細菌，詳見表2。

表2 養殖場環境中細菌的種類情況

2.1.1 空氣樣本細菌分離鑒定結果經鑒定，從空氣樣本中分離獲得23株細菌，其中革蘭氏陽性菌（G+）14株（60.87%），革 蘭 氏 陰 性 菌（G-）9株（39.13%），革蘭氏陽性菌中以葡萄球菌數量最多，獲8株菌，占34.78%（8/23），具體結果見表3。

表3 空氣樣本中各種細菌檢出率

2.1.2 水樣本細菌分離鑒定結果經鑒定，從采集的水樣本中分離到18株細菌，其中G+菌7株（38.89%），G-菌11株（61.11%）。從水樣本中分離到的細菌主要是G-菌，且多數是些條件致病菌，結果見表4。

表4 水樣本中各種細菌檢出率

2.1.3 土壤樣本細菌分離鑒定結果經鑒定，從采集土壤樣本中分離到20株細菌，其中G+菌14株（70.00%），G-菌6株（30.00%）。除了常見的細菌外，還分離到一些不常見的細菌如破傷風桿菌和李氏桿菌，結果見表5。

表5 土壤樣本中各種細菌檢出率

2.2 動物致病性試驗

結果表明，部分分離菌株對小白鼠有致病性，致病性菌株占菌株總數的36.07%。61株分離菌中有些致病力強，有些無致病性，致病率比較高的是產氣莢膜 梭菌、破傷風桿菌、李氏桿菌及沙門氏菌，結果見表6。

表6 環境細菌致病性試驗結果

3 討論與結論

本次試驗從3類樣本中共分離出14種細菌，61個菌株，其中革蘭氏陰性菌26株（42.62%），革蘭氏陽性菌35株（57.38%）。空氣樣本檢出7種細菌，共23株細菌，以葡萄球菌居多，占34.78%（8/23）；水樣本共分離出11種細菌，以G－檢出率最多,共分離出11株,占61.11%（11/18）；土壤樣本分離出9種細菌，除常見細菌外，還分離到破傷風桿菌和李氏桿菌，應引起高度重視，并且葡萄球菌和大腸桿菌檢出率最多（15.00%）。在所采集的3種環境樣品中，以葡萄球菌分離率最高，占19.67%（12/61），說明葡萄球菌為環境的主要污染菌，提示外科手術及創傷處理時應遵守無菌操作原則，使用敏感抗菌藥物預防術后感染，平時要加強對糞污、廢棄物及病死動物尸體進行無害化處理，要加強周圍環境的消毒。小白鼠致病性試驗結果顯示，61株分離菌中有36.07%（22/61）菌株有致病性，39株沒有致病性，表明養殖場環境中的細菌種類多樣且存在大量的致病菌，提示養殖實訓場要注意做好細菌性疾病的防治工作，平時要保持動物欄舍清潔干燥，定期監測環境中的細菌種類，定期消毒，特別是氣溫變化、環境潮濕時更要嚴格消毒，并輪換使用不同品牌不同類別的消毒藥。

此次調查還發現，致病菌中有1株是蠟樣芽孢桿菌，提示應重視當蠟樣芽孢桿菌用作益生菌時的安全性檢測，以防止致病性蠟樣芽孢桿菌的潛在危害。此外，在分離到的致病菌中有4株是產氣莢膜梭菌，此菌形成芽胞后對環境因素及消毒藥抵抗力較強，在自然界長期存活，感染途徑主要是通過消化道，提示平時要搞好環境衛生和保證飼料、飲水的清潔，以預防本病發生。

本次試驗采集的樣本是在雞、牛的欄舍進行取樣，采集樣本有一定的局限性，其它如豬、馬動物舍細菌污染情況怎樣，致病性情況如何，需要日后有待進一步的探究。