麝香烏龍丸對(duì)RA 患者外周血單核細(xì)胞中miRs 表達(dá)水平的影響

王志文，張凱淇，曹穎，王松松，張志慧，馬煒秀，梅曉峰，侯淋飛

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山；2.華北理工大學(xué)，河北 唐山)

0 引言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種由于炎癥細(xì)胞增殖，覆于關(guān)節(jié)囊內(nèi)面的結(jié)締組織增厚，血管翳大量生成導(dǎo)致骨連接處損傷和骨損傷為主要病理表現(xiàn)的自身免疫性疾病。微小核糖核酸(microRNA，miR)是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA 分子，普遍存在病毒和人類的各種生物中。這些mirna 在正常情況下，通過(guò)一個(gè)或者多個(gè)靶向信使RNA 的轉(zhuǎn)錄水平，來(lái)抑制基因表達(dá)，而且在不同的的細(xì)胞和環(huán)境中，RNA 結(jié)合的蛋白產(chǎn)生的效果也會(huì)不同，如控制微生物的凋亡和生長(zhǎng)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和MHC分子傳遞的抗原，從而在自身免疫性疾病的調(diào)控中表達(dá)出關(guān)鍵效果[1-3]。因此本次研究選擇了與RA 發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的miR-451 和miR-326，通過(guò)研究麝香烏龍丸，RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)中miRNAs相對(duì)表達(dá)的變化，探討麝香烏龍丸治療RA 的作用效果。

1 志愿者招募

在2017 年12 月至2018 年2 月，在華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫門(mén)診第一次確診還未服用抗風(fēng)濕類藥物的治療的患者30 例。并且符合以下條件。

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

RA 的分類標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分體系參考2010 年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)[4]

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

1)確診為RA 評(píng)分在6-8 分的患者；2)未經(jīng)過(guò)抗風(fēng)濕治療；3)自愿參加本次課題，并且簽訂協(xié)議書(shū)；4)年齡在20-50 歲。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

1)同時(shí)發(fā)作其他自身免疫系統(tǒng)疾病的患者，例如脈管炎，皮肌炎等；2)患有嚴(yán)重的心腦血管性疾病，肺部疾病，肝腎功能異常的病人；3)患有血液疾病或者消化系統(tǒng)疾病；4)妊娠或者處于哺乳期婦女；5)由其他原因引起的免疫功能異常的患者。

2 材料與方法

2.1 主要試劑和儀器

麝香烏龍丸：通過(guò)人工麝香、制川烏、生地龍、生全蝎、生黑豆五味藥物制成，冀藥制字：Z20051581。人外周血淋巴細(xì)胞分離液(武漢普諾賽生命科技有限公司)；胎牛血清(美國(guó)gibco 公司)；RPMI 1640 培養(yǎng)基(江蘇永華化學(xué)科技有限公司)；TRIZOL(德國(guó)賽默飛公司)；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)賽默飛公司)；PCR 試劑盒(德國(guó)賽默飛公司)；RNA 酶抑制劑(美國(guó)APExBIO 公司)。流式細(xì)胞儀(德國(guó)賽默飛公司)；梯度PCR 儀(德國(guó)賽默飛公司)；定量PCR 反應(yīng)機(jī)(上海普迪生物技術(shù)有限公司)。

2.2 mirna 表達(dá)檢測(cè)

2.2.1 PBMCs 的提取

選取好的30 位患者上臂靜脈處采集5mL 靜脈血后1h內(nèi)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的超凈臺(tái)內(nèi)提取細(xì)胞，分離獲得PBMCs細(xì)胞；在外流式超凈臺(tái)下，控制5mL 抗凝血沿順壁管緩慢倒入裝盛好5mL 人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心后分取第二層于新的無(wú)菌離心管內(nèi)，加入2 倍體積的PBS 緩沖液；10g(1500rpm/min)，棄上清；重復(fù)清洗一次，重懸細(xì)胞備用。

2.2.2 含藥血清的制備和給藥干預(yù)

采用完全隨機(jī)性方式將18 只SPF 級(jí)wister 大鼠分成2組，生理鹽水組(10mL/kd/d)和給藥組(根據(jù)體表面積法算出200mg/mL)給藥21d 后取含藥血清。

將單個(gè)核細(xì)胞用營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)(含10%FBS，1%雙抗的1640培養(yǎng)基) 重懸，轉(zhuǎn)移到96 孔板中，37 ℃、5% CO2 條件培養(yǎng)24h 后細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞按照完全隨機(jī)性原則分為3 組，每組10 份：1)空白對(duì)照組；2)空白血清組；3)麝香烏龍丸含藥治療組。分別給予含10%胎牛血清、10%生理鹽水大鼠血清、10%麝香烏龍丸含藥血清，隨后繼續(xù)培養(yǎng)48h。

2.2.3 總RNA 提取和cDNA 合成

細(xì)胞離心后棄營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，PBS 清洗細(xì)胞，離心棄上清，滴入1mLtrizol 細(xì)胞組織快速裂解液，吹打數(shù)次，收存液體置于冰上，加入200ul 氯仿，劇烈搖晃30s，靜止3min，離心15min(12000rpm/min) 取第一層液體于新EP 管，加入400ul異丙醇，混勻后靜置5min 棄異丙醇，用75%酒精輕洗EP 管并吸出。加入20-30ulDEPC 水，使RNA 溶解，-80° 冰箱保存。按照cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)賽默飛公司)說(shuō)明書(shū)合成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 引物序列

miR-451 的 引 物 序 列：FPrimer 5'-AAACCGTTACCATT ACTGAG;

RPrimer 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG

miR-326 的引物序列：FPrimer 5'-CTCATCTGTCTGTTGG GCTGGAG

RPrimer 5'-AGGGCCCAGAGGCGATCT

U6snRNA 的 引 物 序 列：FPrimer 5'- GCTCGCTTCGGC AGCACA -3'；RPrimer 5'- GAGGTATTCGCACCAGAGGA -3'。miR-451 和miR-326 及U6snRNA 均由恪敏生物科技(上海)有限公司合成。

2.2.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 檢miR

以U6snRNA 為內(nèi)參照，每組樣品設(shè)計(jì)三個(gè)復(fù)孔。PCR 反應(yīng)條件：95 攝氏度預(yù)熱5min；94 攝氏度15s，58 攝氏度30s，70 攝氏度34s，總共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt 表示每種miR 相對(duì)表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。采用單因素方差分析(One-way，ANOVA)進(jìn)行多組間比較，方差齊兩兩比較采用小差異法(leastsignificantdifference，LSD)檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)。

3 結(jié)果

如表1 所示，空白血清組與空白對(duì)照組的miR-451 和miR-326 表達(dá)水平，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與空白血清組、空白對(duì)照組相比，含藥治療組miR-451 基因表達(dá)水平升高，miR-326 基因表達(dá)水平降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。含藥治療組miR-451 表達(dá)上調(diào)，miR-326 基因表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 4 組miR-451 和miR-326 的表達(dá)水平的比較

4 討論

麝香烏龍丸組成包括：麝香，制川烏，全蝎，地龍和黑豆。以麝香辛溫走全身經(jīng)脈活血止痛，以制川烏辛苦大熱散風(fēng)祛濕，尤其是在治療RA 時(shí)可以緩解患者關(guān)節(jié)怕冷問(wèn)題，地龍全蝎共用搜剔寒濕，通絡(luò)止痛，黑豆甘平滋補(bǔ)肝腎，緩解藥物毒性[5，8-11]。現(xiàn)代藥理學(xué)證明本方組成藥具有抑制炎癥因子濃度和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。以前的臨床研究已證實(shí)，麝香烏龍丸能夠減少RA 患者血清中促炎因子的表達(dá)[5,12]。本課題從本藥調(diào)控miRNAs 的表達(dá)量上入手，更深入的揭露了其治療免疫性疾病的機(jī)制。

雖然現(xiàn)在RA 根本發(fā)病原因沒(méi)有完全清楚，但越來(lái)越多的證據(jù)表示，miRNAs 表達(dá)量的變化可能影響了RA 的病情進(jìn)展[13-15]。我們發(fā)現(xiàn)miR-451 在紅細(xì)胞、血小板和中性粒細(xì)胞中表達(dá)最為明顯，這樣當(dāng)患病處血流量減少，就會(huì)加劇患病處的病情發(fā)展，當(dāng)miR-451 表達(dá)下調(diào)，會(huì)導(dǎo)致il-6、TNF-α、CCL3、CCL5 和IFN-γ 的表達(dá)量增加，甚至是包括P38MAPK下游的IL-1 和環(huán)氧化酶2，從而促進(jìn)自身免疫關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展[16]。MiR-326 作為T(mén)h-17 細(xì)胞的分化的上行調(diào)節(jié)器，可減少Th-17 細(xì)胞數(shù)量來(lái)緩解RA 的關(guān)節(jié)破壞進(jìn)展[17]。已有研究表明miR-326 在體內(nèi)沉默可減少Th-17 細(xì)胞數(shù)量[18]。而Th-17 細(xì)胞因子具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用[19-21]，從而導(dǎo)致類風(fēng)濕骨關(guān)節(jié)的破壞，而且Th-17 還可以通過(guò)自我產(chǎn)生的白介素(IL)-17 進(jìn)行促炎癥反應(yīng)，IL-17 具有誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生(如TNF-α，IL-6 和IL-1β)，趨化因子(單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白MCP-1 和MICP-2)導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織被入侵和軟骨的破壞[22,23]。

在RA 疾病進(jìn)展中，mir-326 具有維持炎癥反應(yīng)，破壞骨關(guān)節(jié)的作用，而mir-451 具有抑制炎癥因子作用。而且在自身免疫性疾病過(guò)程中，是一種全身性病變，而通過(guò)對(duì)MIRNA進(jìn)行研究，可以從微觀層面上，發(fā)現(xiàn)疾病的發(fā)生和變化，進(jìn)而為治愈類風(fēng)濕提供可靠的基礎(chǔ)研究。本研究表明，我們的實(shí)驗(yàn)用藥可以下調(diào)患者外周血PBMCs 中miR-326 表達(dá)，上調(diào)miR -451 的表達(dá)，提示麝香烏龍丸有可能通過(guò)調(diào)控miR-326和miR -451 的表達(dá)水平來(lái)減輕全身的不良免疫反應(yīng)，保護(hù)RA 病變局部組織。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)觀察了麝香烏龍丸對(duì)RA患者外周血miRs 表達(dá)水平的影響，為本藥在DNA 層面上治療類風(fēng)濕提供理論基礎(chǔ)，對(duì)探討藥物的作用機(jī)制具有積極的意義。