杞菊地黃丸對(duì)D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用的研究

高立揚(yáng)，薛丹，衛(wèi)小杰，馮一丹，閆盎然，楊嘯，呂蕊花

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng))

0 引言

衰老是生命體發(fā)展的必然趨勢(shì)，自古以來(lái)長(zhǎng)生不老都是人們向往的一種情境。我國(guó)是世界上老年人口最多、增加速度最快的國(guó)家，老齡化速度明顯高于其他國(guó)家，因此研究衰老的機(jī)制、尋求抗衰老的方法刻不容緩。自由基與衰老密切相關(guān)，活性氧的增多會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)自由基失衡，促進(jìn)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷[1]。超氧化物歧化酶(SOD)是體內(nèi)主要抗氧化酶，其活性的高低可間接反映機(jī)體消除自由基的能力[2]。自1969年被Irwin Fridovich發(fā)現(xiàn)SOD以來(lái)，便受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，涉及到化學(xué)、生物、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)SOD可以保護(hù)由輻射引起的肺纖維化[3]。

中醫(yī)對(duì)于衰老的認(rèn)識(shí)和研究歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，《黃帝內(nèi)經(jīng)》闡述了許多延緩衰老的養(yǎng)生方法，后代的眾多中醫(yī)藥學(xué)家在此基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)展與創(chuàng)新，完善并擴(kuò)展了中醫(yī)衰老理論，概括地說(shuō)：主要是腎虛所導(dǎo)致的衰老、脾胃虛弱所導(dǎo)致的衰老、陰陽(yáng)失調(diào)至衰、情志至衰等。杞菊地黃丸起自張仲景《金匱要略》的八味丸，由錢(qián)乙改良成六味地黃丸，后人在此基礎(chǔ)上加了枸杞、菊花演變而成，具有滋腎養(yǎng)肝之功效，用于肝腎陰虧的眩暈、耳鳴、目澀畏光、視力昏花。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究杞菊地黃丸對(duì)D-半乳糖引起的快速衰老小鼠SOD活性的影響，同時(shí)關(guān)注其對(duì)大腦、腎臟和脾臟系數(shù)的影響，以探討杞菊地黃丸抗衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠30只(購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，雌性，4-5周齡，體重18-22g。

1.2 儀器

RT-2100C型酶標(biāo)儀，恒溫培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫水浴鍋，電熱干燥箱，離心機(jī)。

1.3 藥品與試劑

蘭州佛慈杞菊地黃丸(采購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院)，D-半乳糖(Amresco)(采購(gòu)自成都里來(lái)生物科技有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(采購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，0.22μm一次性針頭式過(guò)濾器(Millipore)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組與處理

適應(yīng)性飼養(yǎng)2w后，將30只小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，即空白對(duì)照組、衰老模型組、杞菊地黃丸組。衰老模型組和杞菊地黃丸組小鼠于每天上午10：00時(shí)，用一次性注射器經(jīng)頸背部皮下注射過(guò)濾除菌的10%D-半乳糖，連續(xù)注射42d；杞菊地黃丸組的小鼠從第15d開(kāi)始，采取灌胃的方式按照0.1g/10g的量給予10%的杞菊地黃丸溶液，每天10：00和18：00各灌胃一次，連續(xù)處理28d；空白對(duì)照組與模型組每次用等量的生理鹽水灌胃。

2.2 小鼠一般行為學(xué)觀察

每天對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行觀察，包括活躍程度、進(jìn)食量、飲水量、毛色等。

2.3 標(biāo)本的采集及檢測(cè)

2.3.1 小鼠臟器系數(shù)的測(cè)定

于最后一次給藥的第二天，將各組小鼠分別稱重并記錄，取小鼠目?jī)?nèi)眥血后，采用頸椎脫臼法處死。分別取各組小鼠的大腦、腎臟、脾臟，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重，并計(jì)算其臟器系數(shù)[臟器系數(shù)(mg/g)=臟器濕重(mg)/小鼠質(zhì)量(g)]。

2.3.2 小鼠血清SOD活性檢測(cè)

將取出的小鼠目?jī)?nèi)眥血置于1mL離心管中，3000r離心10min進(jìn)行血清分離，取上清液用于測(cè)定小鼠目?jī)?nèi)眥血血清SOD活性。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)指標(biāo)

經(jīng)對(duì)小鼠行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠攝食量正常，飲水適量，精神良好，反應(yīng)靈敏，毛色光滑。衰老模型組小鼠隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)食欲下降、自發(fā)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍。杞菊地黃丸組相對(duì)衰老模型組小鼠癥狀有所改善。

3.2 臟器系數(shù)

測(cè)定結(jié)果表明，相對(duì)于空白對(duì)照組，衰老模型組的腦系數(shù)、腎系數(shù)和脾系數(shù)均下降，但差異不顯著(P＞0.05)；將杞菊地黃丸組與衰老模型組進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，杞菊地黃丸組的腦系數(shù)、腎系數(shù)和脾系數(shù)均增高，差別也不顯著(P＞0.05)(表1)。

表1 臟器系數(shù)測(cè)定結(jié)果

3.3 血清SOD活性

超氧化物歧化酶測(cè)定結(jié)果表明(圖1)，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組與杞菊地黃丸組的SOD活力明顯下降，差異極顯著(P＜0.01)，表明造模成功；杞菊地黃丸組與衰老模型組相比，SOD活力上升4.6%，但差別不顯著(P＞0.05)。

4 討論

杞菊地黃丸能改善由D-半乳糖所導(dǎo)致的快速衰老小鼠的外觀，增加腦、腎、脾的臟器系數(shù)，使血液中的SOD的活力升高，但升高的作用不太明顯，這可能與灌胃的劑量有關(guān)。杞菊地黃丸主要通過(guò)滋腎養(yǎng)肝健脾的方法延緩衰老。

圖1 血清SOD活性測(cè)定結(jié)果

中醫(yī)關(guān)于衰老的原因呈百家爭(zhēng)鳴的狀態(tài)，主要分為3個(gè)學(xué)說(shuō)，一是腎臟虛衰學(xué)說(shuō)，二是脾胃虛衰學(xué)說(shuō)，三是心臟虛衰學(xué)說(shuō)，現(xiàn)在大部分人認(rèn)可的為第一種學(xué)說(shuō)。杞菊地黃丸的主要成分是枸杞子和菊花，其中枸杞中的枸杞多糖可有效延緩衰老，對(duì)成纖維細(xì)胞的衰老具有拮抗作用，能延遲細(xì)胞進(jìn)入衰老和凋亡狀態(tài)[4]，此外，枸杞多糖對(duì)于D-半乳糖導(dǎo)致的亞急性衰老模型小鼠也具有抗衰老作用[5]。菊花歸肺、肝經(jīng)，其功能主治散風(fēng)清熱，平肝明目，不同類型的菊花均具有抗衰老、抗氧化和抗炎的功效[6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杞菊地黃丸具有一定的抗衰老作用，其作用主要途徑是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。