高頻重復經顱磁刺激預處理對全腦缺血大鼠再灌注損傷的影響

任麗君，吳碧華 ，劉俊，張梅，楊興

1.川北醫學院附屬醫院老年科，四川 南充 637000；2.廣安職業技術學院醫學院，四川 廣安 638000

1986年，MURRY等[1]首次提出了缺血耐受現象。1990年，KITAGAWA等[2]發現，全腦1次短暫性缺血可以對再次致死性缺血損傷有明顯的保護作用，證實了腦缺血耐受現象的存在，第一次短暫腦缺血稱為缺血預處理。隨后越來越多的研究報道了缺血預處理的腦保護作用，如缺氧[3]、低溫[4]、皮層擴散性抑制[5]、遠隔器官缺血[6]、電針[7]、化學物質[8]均可以誘導腦缺血耐受。然而，這些預處理方法大多會對機體造成潛在的傷害，因此尋找較為安全的預處理方法尤為重要。

重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)是將一定頻率和強度的磁脈沖以成串刺激的方式以一定時間間隔連續發放，由于其安全無創常用于治療方面的研究。本研究團隊前期實驗發現，對全腦缺血大鼠進行連續兩周的高頻rTMS刺激，大鼠的學習記憶能力得到改善[9]。本實驗將進一步探討高頻rTMS刺激預處理對全腦缺血大鼠再灌注腦損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型制備 成年雄性SD大鼠，體質量(230±20)g，均購自川北醫學院動物實驗中心[許可證號：scxk(川2008-18)]，隨機區組法分為對照組、模型組、rTMS預刺激3次、rTMS預刺激7次，每組10只。模型組和rTMS預刺激組采用改良四血管阻斷法(4-VO法)[10]造模，凝閉雙側椎動脈，24 h后夾閉雙側頸總動脈15 min，松開動脈夾后恢復血流灌注，制備全腦缺血再灌注損傷模型。

1.2 高頻rTMS刺激 磁刺激頻率10 Hz，100個脈沖/串，12串/d，每串間隔30 s，刺激強度為0.5 T。腦缺血再灌注模型與磁刺激間隔為48 h，rTMS預刺激組分別于造模前給予磁刺激3次和7次。

1.3 改良神經功能評分 再灌注24 h后，采用改良神經功能缺損評分(mNSS)[11]評估大鼠神經功能損傷程度。mNSS評分包括行動能力測試、感覺測試、反射測試3大項，14小項，總分14分。評分越低，損傷程度越輕。

1.4 血腦屏障通透性 對大鼠進行mNSS評分，然后用10%水合氯醛(3.8 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后，尾靜脈注射2%伊文思藍4 mL/kg。2 h后心臟灌流，冰盒上迅速分離腦組織，將腦組織9 mL/g浸入甲酰胺溶液中，45℃避光孵育72 h，15 000 r/min離心20 min，取上清。酶標儀測量光密度(optical density，OD)值，根據標準曲線讀出伊文思藍濃度。

1.5 蛋白免疫印跡法 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，分離海馬組織，將組織研磨后加入蛋白裂解液，取上清液，用二喹啉甲酸法進行蛋白定量，然后進行電泳、轉膜和封閉，在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上分別滴加1∶5 000兔抗鼠BDNF、1∶1 000兔抗鼠pTrkB，4℃孵育過夜，滴加山羊抗兔IgG抗體37℃孵育2 h，在PVDF膜上滴加適量ECL發光液，放入曝光儀曝光顯影，用Quantity One軟件分析檢測目的蛋白條帶的灰度值，用目的條帶灰度值除以相應β-肌動蛋白條帶灰度值得到目的蛋白條帶灰度值比值。

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行數據分析。計量資料呈正態分布，以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的神經功能缺損評分比較 rTMS預處理組mNSS評分較模型組降低，rTMS預處理7次mNSS評分較rTMS預處理3次降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠的神經功能缺損評分(±s)

表1 各組大鼠的神經功能缺損評分(±s)

注：rTMS刺激組與模型組比較，aq=3.543，P=0.028，bq=3.729，P=0.017；rTMS預刺激7次組與rTMS預刺激3次組比較，cP=4.354，P=0.015。

對照組模型組rTMS預刺激3次組rTMS預刺激7次組F值P值10 10 10 10 0 9.87±1.23 7.42±1.76a 5.38±1.91bc 3.873 0.021

2.2 各組大鼠的伊文思藍含量比較 模型組伊文思藍含量較對照組升高，rTMS刺激組伊文思藍含量較模型組降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠伊文思藍含量比較(±s)

表2 各組大鼠伊文思藍含量比較(±s)

555 9.383±1.093 29.829±8.633a 17.538±1.984b 5.993 0.018

2.3 各組大鼠BDNF和pTrkB免疫印跡表達水平比較 模型組BDNF和pTrkB蛋白表達較對照組減少，rTMS刺激組BDNF和pTrkB蛋白表達較模型組增多，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；rTMS預刺激7次組BDNF和pTrkB蛋白表達較rTMS預刺激3次組增多，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3和圖1。

圖1 各組大鼠腦源性神經營養因子、磷酸化酪氨酸激酶受體B免疫印跡法檢測結果

表3 各組大鼠BDNF和pTrkB免疫印跡表達水平比較(±s)

表3 各組大鼠BDNF和pTrkB免疫印跡表達水平比較(±s)

注：對照組與模型組比較，aq=4.032，P=0.012，bq=3.583，P=0.028；模型組與 rTMS 預刺激 3次組比較，cq=3.153，P=0.047，dq=3.492，P=0.035；模型組與rTMS預刺激7次組比較，eq=4.089，P=0.014，fq=3.967，P=0.018；rTMS預刺激3次組與rTMS刺激預7次組比較，gq=4.127，P=0.027，hq=3.895，P=0.041。

組別對照組模型組rTMS預刺激3次組rTMS預刺激7次組F值P值pTrkB 28.834±2.197 4.211±0.078b 8.830±1.142d 16.876±1.873gh 4.289 0.026只數5555 BDNF 31.971±2.381 12.093±1.289a 16.683±1.492c 23.247±1.782ef 5.038 0.018

3 討論

重復經顱磁刺激能對刺激局部和功能相關的遠隔部位產生影響，由于其安全無創常用于臨床方面的研究[12]。研究報道，rTMS對認知功能障礙[13]、重癥抑郁[14]等神經精神疾病有肯定療效，rTMS可促進缺血性腦卒中運動感覺障礙[15]、構音障礙[16]、單側空間忽略[17]等功能的恢復。

近年來研究報道，rTMS預處理能誘導腦缺血耐受，LJUBISAVLJEVIC MILOS等[18]的研究表明，rTMS預處理可以通過調控相關基因表達，誘導合成具有神經保護作用的蛋白，從而促進大鼠缺血再灌注神經功能損傷的恢復。本研究發現，高頻rTMS預處理可以降低腦缺血大鼠mNSS評分，改善缺血再灌注神經功能損傷，rTMS預刺激7次組效果更顯著，表明高頻rTMS預處理對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用可能有時間累積效應。

伊文思藍常用于血腦屏障功能的檢測，當血腦屏障受損時，伊文思藍可以迅速與白蛋白結合并隨之滲漏至腦組織中。研究發現，運動預處理[19]及藥物[20-21]能改善血腦屏障的通透性。本實驗中，rTMS刺激組伊文思藍含量較模型組降低，推測高頻rTMS預處理能改善腦缺血大鼠血腦屏障的通透性。血腦屏障破壞以及腦水腫，在急慢性腦缺血再灌注神經功能損傷中扮重要角色[22]。高頻rTMS預處理改善血腦屏障通透性，可能是其改善缺血再灌注神經功能損傷的機制之一。

腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通過多種機制發揮神經保護作用，如促進神經元的存活，抑制神經元及少突膠質細胞的凋亡，促進突觸的生長和軸突再生等[23]。BDNF與特異性受體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)結合，生成具有生物活性的磷酸化酪氨酸激酶受體B(pTrkB)，pTrkB可募集下游效應因子，誘導引起生長和分化的細胞內信號級聯活化[24]。ZHAO等[25]的研究表明，人臍帶間充質干細胞外泌體中的miR-206通過激活BDNF/TrkB/CREB信號通路，對蛛網膜下腔出血繼發的早期腦損傷有神經保護作用。MITROSHINA等[26]發現，BDNF具有神經保護作用，能夠減少原代培養海馬神經元缺血性損傷引起的細胞凋亡。

本實驗Western blotting結果表明，高頻rTMS預處理能上調缺血再灌注大鼠腦組織BDNF和pTrkB蛋白表達，進而產生神經保護作用，改善腦缺血再灌注神經功能損傷。

綜上所述，高頻rTMS預處理可以改善全腦缺血再灌注大鼠神經功能損傷，其機制可能與其改善血腦屏障的通透性、誘導具有神經保護作用的蛋白表達增加相關。