嬰兒血管瘤長鏈非編碼RNA與mRNA表達譜分析

楊開穎 代詩懿 邱桐 周江元 陳思源 吉毅

1四川大學華西醫院小兒外科，成都610041；2四川大學華西醫院重癥醫學科，成都610041

嬰兒血管瘤（infantile hemangioma，IH）是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，發病率為4%～5%［1］。絕大多數IH 可自然消退，但仍有10%～15%的IH 可引起嚴重并發癥［2］。研究表明，血管發生與血管生成均參與IH的發病過程，但確切機制尚不清楚［3］。目前，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）已被證實在內皮細胞分化及血管生成等方面發揮重要調控作用［4］。本研究旨在通過基因芯片技術分析增殖期與消退期IH的lncRNA差異表達情況，并利用生物信息學技術分析lncRNA 參與調控IH發病的機制。

對象與方法

一、對象

2019年1-3月在四川大學華西醫院小兒外科行手術切除治療（在向所有患兒家屬介紹如口服普萘洛爾等非手術治療的前提下，家屬綜合考慮后首先選擇手術切除治療）的8 例IH 組織（表1），所有患兒在術前均未采取過任何治療措施。術中將切下標本組織分成兩份，一份立即轉運至-80 ℃冰箱長期儲存；另一份用于病理診斷及分期。經HE 染色（圖1）和免疫組化葡萄糖轉運蛋白1（GLUT-1）染色（圖2）分析，結合臨床特征，依據文獻［5］確診增殖期與消退期各4 例。其中，增殖期IH 顏色鮮艷，瘤體會逐漸生長并凸出體表，表面張力大；消退期IH顏色暗紅，瘤體逐漸縮小變軟，中心可以緩慢退化變白。本研究獲得四川大學華西醫院倫理委員會批準（批件號：2017414），取材前所有患兒家屬簽署知情同意書。

二、方法

1.RNA提取和lncRNA與mRNA表達譜芯片制備：采用Trizol試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）提取組織中總RNA，采用miRNeasy Minikit試劑盒（美國Qiagen 公司）將RNA 提純，使用Nano Drop 2000（美國Thermo Fisher Scientific 公司）分光光度計對RNA 進行定量，同時進行瓊脂糖凝膠電泳質檢，最終將制備的RNA樣本儲存于-80 ℃液氮中備用。采用Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0二代高通量芯片（美國賽默飛世爾科技公司）分析增殖期與消退期IH lncRNA與mRNA的差異表達譜，包含245 000余條mRNA探針和40 000余條lncRNA探針。每個標本都進行標準化的芯片上樣處理。基因芯片探針設計由上海其明科技有限公司完成。

表1 8例嬰幼兒局灶性混合型血管瘤臨床相關資料

圖1 嬰兒血管瘤皮損病理表現（HE×400） 1A：增殖期血管瘤內皮細胞高度增殖，血管管腔密集，罕見脂肪組織；1B：消退期血管瘤內皮細胞逐漸成熟，血管團塊逐漸形成管腔結構，血管管腔粗大肥厚，脂肪組織浸潤增多 圖2 免疫組化檢查（葡萄糖轉運蛋白1 染色×400） 2A：增殖期血管瘤血管內皮細胞染色陽性且豐富表達；2B：消退期血管瘤血管內皮細胞表達葡萄糖轉運蛋白1，但表達強度減少

2.生物信息學分析：①通過基因芯片篩選得到差異表達的lncRNA 與mRNA（篩選標準：P ＜0.05，差異倍數＞1.5）；②對差異表達mRNA 進行GO 功能和KEGG 通路富集分析；③構建lncRNA-mRNA共表達網絡，以相關系數＞0.97 或＜-0.97 及P ＜0.05 為標準進行lncRNA 靶基因篩選，并用Cytoscape 軟件對其進行可視化處理；④對lncRNA靶基因進行GO和KEGG分析，以預測lncRNA功能作用。以上分析在上海其明公司GCBI（https：//www.gcbi.com.cn/）平臺完成。

3. 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證：采用SYBR Green qPCR方法，驗證增殖期與消退期IH組織中部分差異lncRNA 與mRNA 的表達，重復3次。采用TRIzol 試劑提取組織中總RNA 后進行核酸定量，參照cDNA 合成試劑盒說明書進行反轉錄，選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參基因，引物序列詳見表2。qPCR（美國賽默飛世爾科技公司）實驗反應條件為：95 ℃30 s；95 ℃15 s，60 ℃30 s共40個循環，最后做熔解解曲線分析。每份樣品重復檢測3次，采用2-△△Ct法計算差異lncRNA 與mRNA的相對表達量。

4.統計學分析：采用SPSS 23.0 軟件進行數據統計分析，連續性變量用±s 表示，采用獨立樣本t 檢驗比較組間差異（P ＜0.05，差異倍數≥1.5）。P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、增殖期和消退期IH差異表達的lncRNA與mRNA

以消退期IH 組織為參照組，增殖期IH 中共篩選出405條差異lncRNA，其中108條下調，297條上調，同時篩選出772 條差異mRNA，其中107 條下調，665 條上調（圖3）。前20 條差異lncRNA 與前30條差異mRNA分別見表3和表4。

二、增殖期和消退期IH差異mRNA的GO功能與KEGG通路富集分析

GO 功能分析顯示，差異mRNA 主要參與血管凝固、軸突導向、血管生成和細胞黏附以及對缺氧反應、凋亡過程、細胞增殖負調控等生物過程；KEGG 通路分析發現，差異mRNA 主要富集在代謝通路、細胞局部黏附、肌動蛋白細胞骨架調控、白細胞跨內皮遷移、磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）、血管平滑肌收縮等信號通路（圖4）。

三、增殖期和消退期IH lncRNA-mRNA 共表達網絡

經Cytoscape 可視化處理后生成的lncRNAmRNA 共表達網絡由370 個節點及1 244 條關系組成。為更好地展示lncRNA-mRNA 共表達網絡關系，選取度值（degree，一個點的度指圖中該點所關聯的邊數）≥15的差異lncRNA和mRNA構建相互作用網絡，該網絡由81個節點（23條mRNA和58條lncRNA）及269條關系組成。從此網絡中可知，1條lncRNA 可同時與多條mRNA 發生相互作用關系（圖5）。

四、增殖期和消退期IH lncRNA靶基因預測

結合lncRNA-mRNA共表達網絡，對lncRNA進行靶基因順式作用（cis）預測。通過尋找lncRNA上下游10 kb 范圍之內的mRNA，以相關系數＞0.97或＜-0.97 及P ＜0.05 為標準共篩選出18 對lncRNA-mRNA（表5）。對這些lncRNA預測的靶基因進行GO 功能及KEGG 通路分析，發現這些基因主要富集在“正向調控神經元分化”、“正向調控細胞分化”及“細胞膜電位調控”等生物過程以及“胰腺分泌信號通路”與“環腺苷酸信號通路”等。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

圖3 增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達的lncRNA（3A）與mRNA（3B）聚類圖 P：增殖期；I：消退期。在增殖期血管瘤中表達上調的lncRNA或mRNA均要比消退期多

表3 增殖期和消退期嬰兒血管瘤前20條差異（P ＜0.001）表達的lncRNA

表4 增殖期和消退期嬰兒血管瘤前30條差異（P ＜0.001）表達的mRNA

圖4 增殖期和消退期嬰兒血管瘤前20條差異表達的mRNA GO功能（4A）及KEGG通路（4B）富集結果

圖5 度值（degree）≥15 的lncRNA-mRNA 共表達網絡圖●代表mRNA，代表lncRNA；紅色代表上調，黃色代表下調。1條lncRNA可同時與多條mRNA發生相互作用關系

表5 增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達的lncRNA靶基因預測

五、qRT-PCR驗證結果

隨機選擇差異表達的4 條lncRNA（n335248、ENST00000450864、n333319 和n335185）與4 條mRNA（EDNRA、IFI6、HK2 與ITGA1）進行qPCR 驗證，結果與芯片檢測結果一致。見圖6、表6。

討 論

圖6 qRT-PCR 結果驗證增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達的lncRNA 與mRNA 1：IFI6；2：HK2；3：ITGA1；4：EDNRA；5：n335248； 6：n333319； 7：n335185； 8：ENST00000450864。Microarray：基因芯片；qRT-PCR：實時熒光定量PCR

表6 實時熒光定量PCR檢測增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達的lncRNA與mRNA（±s）

表6 實時熒光定量PCR檢測增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達的lncRNA與mRNA（±s）

注：n=3

mRNA/lncRNA IFI6 HK2 ITGA1 EDNRA n335248 n333319 n335185 ENST00000450864增殖期1.25±0.20 0.93±0.14 0.47±0.38 1.20±0.19 0.54±0.46 0.50±0.36 1.16±0.21 1.33±0.30消退期0.68±0.33 1.51±0.83 0.29±0.04 0.66±0.17 0.18±0.09 0.25±0.21 0.98±0.46 2.32±0.99 t值3.13-1.39 0.80 4.12 1.70 1.11 0.58-2.37 P值0.020 0.254 0.455 0.006 0.126 0.304 0.583 0.398

IH 是嬰幼兒時期最常見的良性腫瘤，具有典型的生長特征，即先快速增殖后緩慢消退［2］。研究表明，多條通路及多種基因參與IH 的發病過程［6］，但是IH 從增殖期向消退期演化的機制仍然不明。隨著二代測序技術的發展，基因芯片越來越廣泛地用于輔助臨床疾病的診斷與治療。lncRNA 是長度＞200 個核苷酸的分子，不具有編碼蛋白質功能。研究表明lncRNA 可以參與多種生物學功能，如在轉錄前、轉錄后調控mRNA 表達，從而影響細胞增殖、分化、凋亡和遷移，發揮調控血管生成的作用［7-8］。然而，lncRNA在IH中的表達情況及其所發揮的功能目前仍不清楚。為了更好地研究IH 中lncRNA 的作用，我們通過對比增殖期與消退期IH組織中lncRNA 與mRNA 的差異表達情況，結合生物信息學技術，篩選出與IH 發生發展相關的lncRNA 與mRNA，同時構建lncRNA-mRNA 共表達網絡。該共表達網絡表明，lncRNA 與mRNA 之間的聯系并不是簡單的一一對應關系。1 條mRNA可以由多條lncRNA共同調節，同樣地，1條lncRNA也可以作用于多條mRNA。這進一步佐證了IH 發病機制及發生發展過程的復雜化。通過lncRNAmRNA 共表達網絡，我們對lncRNA 靶基因進行預測，如lncRNA n405879靶基因RAB11A可以通過調控表皮生長因子的表達影響細胞分化［9］，這為進一步深入探討血管瘤的發病機制提供了新方向。

本研究中，共篩選出445 條差異lncRNA 與772 條差異mRNA，這些差異基因不僅包括已經被證實參與調控IH 發病機制的重要基因，如DLL4、HIF1A、JAG1、HEY1 及PDGFRB 等［10-11］，可參與Notch 信號通路，調控血管內皮細胞的增殖與遷移［6］，還包括許多尚未發現與IH 相關的基因，如與血管生成相關的基因LEPREL1、RAMP2 及SERPINE1 等［12-14］，它們可能在IH 發生發展過程中調控血管瘤內皮細胞的增殖、分化等，從而調控IH血管生成。GO 功能富集顯示，差異基因除了富集在血管生成、細胞黏附、對缺氧刺激反應等所熟知的參與IH發病機制的功能外［3］，還富集在一些尚未在IH 領域內被深入研究的新的生物功能，如血液凝固與血小板激活及肌動蛋白細胞骨架等。既往研究顯示，消退期IH 比增殖期IH 中Ⅲ型膠原蛋白和層黏連蛋白大量沉積［15］，普萘洛爾可以通過降低細胞外基質蛋白（基質金屬蛋白酶9）的表達，從而抑制血管瘤內皮細胞血管生成［16］，這些功能均有報道與腫瘤生長存在聯系［17-18］。

同樣，本研究中KEGG 通路分析顯示，差異基因除富集在局部黏附通路、PI3K-Akt信號通路及細胞黏附分子通路等已知的與IH發生發展相關的通路外，還富集在代謝通路、肌動蛋白骨架調控通路、血管平滑肌收縮通路及胰島素信號通路等尚未在IH發病機制中被深入研究的通路。如參與代謝通路的HK2基因，其作為糖酵解通路的關鍵酶之一，可以通過促進乳酸產生從而調控腫瘤生長與遷移［19］，同時研究顯示，PI3K-Akt 信號通路可以通過調控HK2的表達發揮抑制細胞凋亡和促進腫瘤生長的作用［20］，這表明HK2 所參與的糖代謝通路很有可能也在IH發生發展過程中發揮作用。以上結果表明，多種差異基因可能參與多個生物過程以及多條信號通路，共同發揮對IH 發生發展過程的調控。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突