桂花與石楠葉片中瞬時(shí)表達(dá)體系的建立試驗(yàn)初報(bào)

閔思源 陳柏楠 陳康 楊妍 曾祥玲

摘 要 木本植物的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化難以建立或所需時(shí)間長(zhǎng)，而在這些木本植物中建立瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化可大大提高基因功能分析的效率。因此，使用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)侵染技術(shù)，以桂花和石楠葉片為材料，以β-葡糖醛酸酶基因（β-glucuronidase，GUS）作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)的報(bào)告基因，建立瞬時(shí)表達(dá)體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，侵染過程中，農(nóng)桿菌對(duì)于桂花和石楠葉片有一定的毒性，可加速葉片衰敗;蔗糖溶液相對(duì)于水可減緩葉片衰敗;GUS基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可能因?yàn)槿~片木質(zhì)化程度太高或葉片脫色后褐化而無(wú)法檢測(cè)或者沒有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步改進(jìn)桂花和石楠的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)體系提供了借鑒。

關(guān)鍵詞 桂花;石楠;瞬時(shí)表達(dá);遺傳轉(zhuǎn)化

桂花是我國(guó)的十大傳統(tǒng)名花之一，自古享有“獨(dú)占三秋壓眾芳”的美譽(yù)。隨著大量基因測(cè)序工作的完成，我國(guó)對(duì)于植物基因作用的研究也進(jìn)入了更加深入的階段。目前，對(duì)植物基因功能與作用的研究主要通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、基因沉默等方法。瞬時(shí)表達(dá)是最近幾十年來(lái)發(fā)展的一種高速、高效率的檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的辦法，隨著相關(guān)研究不斷深入，逐漸被廣泛應(yīng)用到生物科學(xué)各方面的發(fā)展研究中。植物基因瞬時(shí)表達(dá)體系的構(gòu)建為簡(jiǎn)潔、快速研究啟動(dòng)子活性、基因功能和蛋白質(zhì)定位等開辟了新的途徑[1-3]。園林木本植物中的瞬時(shí)表達(dá)是基因功能檢測(cè)鑒定的有效方法，相較于穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)而言，瞬時(shí)表達(dá)具有一定優(yōu)勢(shì)：1）簡(jiǎn)潔高效，可操作性強(qiáng)，不需要經(jīng)過漫長(zhǎng)的組織培養(yǎng)過程，能夠一周甚至幾天內(nèi)轉(zhuǎn)化基因;2）基因表達(dá)的水平較高;3）安全，因?yàn)楸晦D(zhuǎn)移的基因沒有被整合到基因組中，不會(huì)產(chǎn)生能夠遺傳的下一代，不會(huì)有基因飄移的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)是在比較短的時(shí)間跨度范圍內(nèi)將植物需要表達(dá)的目的基因轉(zhuǎn)化到靶細(xì)胞中，在靶細(xì)胞內(nèi)建立一種暫時(shí)能夠高效表達(dá)的體系。其中，β-葡糖醛酸酶基因（β-glucuronidase，GUS）被作為報(bào)告檢測(cè)基因廣泛應(yīng)用在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中[6]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)方法已經(jīng)發(fā)展成為一種高速、高效率的基因表達(dá)與分析的辦法。它的原理是將目的基因嫁接在表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中，采用農(nóng)桿菌侵染的方法，以GUS和GFP作為報(bào)告基因，建立瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法[7-8]。農(nóng)桿菌菌液的濃度、菌液培養(yǎng)環(huán)境、細(xì)胞的基因型和葉片根莖的生理狀態(tài)對(duì)基因瞬時(shí)表達(dá)都會(huì)有影響，實(shí)驗(yàn)過程中的溫度、光照以及農(nóng)桿菌菌液的類型也是影響瞬時(shí)表達(dá)的因素[9-10]。本研究擬在桂花和石楠葉片中探索瞬時(shí)表達(dá)體系，以期為桂花、石楠以及更多園林木本植物基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采用園林木本植物四季桂和石楠葉片，于2020年4月底采集當(dāng)年生枝條上的成熟葉片。載體采用攜帶35S啟動(dòng)子和GUS報(bào)告基因的pCAMBIA1391載體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌菌液的制備

把準(zhǔn)備好的LB培養(yǎng)基分別加在兩個(gè)消毒的錐形瓶中各5 mL，再用1 000 μL的移液槍各加入1 mL的硫酸卡那霉素（kana）抗生素，挑選培養(yǎng)基平板上單個(gè)含有β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的菌落和單個(gè)含有P19基因的菌落到5 mL LB溶液的錐形瓶中，培養(yǎng)基用完必須密封好并放在4 ℃的條件下保存。將菌液放在恒溫振蕩器的搖床中在200 r·min-1、28 ℃條件下避光12 h左右過夜。待菌液渾濁，用500 mL的LB培養(yǎng)基加入硫酸卡那霉素溶液放入恒溫振蕩器的搖床中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同樣在200 r·min-1、28 ℃避光條件下培養(yǎng)12 h過夜。

1.2.2 瞬時(shí)侵染

將培養(yǎng)的菌液離心收集，然后用侵染液（10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1 MES、150 mmol·L-1 AS）懸浮菌液，調(diào)整OD600至0.5～1.0，室溫靜置2～3 h，用于侵染。將四季桂和石楠的葉片分別用8 mm、10 mm的打孔器各打出200個(gè)不帶葉主脈的圓形小片。把打好的圓形小葉片放入準(zhǔn)備好的菌液侵染液，然后放入真空箱，在0.7 MPa真空條件下保持5 min。把侵染的石楠和四季桂分成16組培養(yǎng)，分別用去離子水和5%蔗糖溶液培養(yǎng)，2 d后進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)各處理編號(hào)如表1所示。

1表示只用侵染液，無(wú)農(nóng)桿菌;2表示用侵染液、P19;3表示用侵染液、GUS;4表示用侵染液和P19∶GUS=1∶1，下同1.2.3 GUS檢測(cè)吸取1 mL X-gluc溶解液加入到X-gluc管中，徹底混勻至完全溶解，即配成X-gluc溶液。將處理好的葉片放入5 mL的離心管中，用配制好的GUS染色工作液完全覆蓋材料，用錫箔紙包好后放入恒溫振蕩器的搖床中在100 r·min-1、37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h。將侵染培養(yǎng)的葉片轉(zhuǎn)入無(wú)水乙醇中，放入恒溫振蕩器的搖床中24 h過夜，再用75%的乙醇溶液放在搖床中繼續(xù)脫水24 h然后用肉眼和顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片離體瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

通過圖1、圖2和表2的比較可以看到桂花和石楠葉片在相同條件下的對(duì)比情況。石楠葉片相較于桂花而言木質(zhì)化程度低，桂花葉片革質(zhì)化嚴(yán)重。在侵染過程中，石楠相較于四季桂而言，葉片更容易褐化、衰敗。另外，離體葉片的培養(yǎng)液選擇對(duì)于葉片的生理活性有一定影響，從圖2可以看出，不同培養(yǎng)條件下，葉片的褐化、衰敗情況不同，農(nóng)桿菌對(duì)于葉片有明顯損害，凡是進(jìn)行了農(nóng)桿菌菌液侵染的葉片都比只用侵染液的葉片褐化、衰敗更為嚴(yán)重。P19可抑制外源基因被植物內(nèi)源免疫系統(tǒng)沉默，提高外源基因瞬時(shí)表達(dá)效率。但圖2對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，是否加入P19基因?qū)τ谌~片的損傷差異不大。

2.2 離體葉片GUS染色分析

對(duì)侵染染色后的桂花和石楠葉片進(jìn)行觀察，如圖3所示，未發(fā)現(xiàn)明顯的藍(lán)色或者淡藍(lán)色斑點(diǎn)或者條紋出現(xiàn)，將16組侵染的葉片在顯微鏡下觀察也沒有發(fā)現(xiàn)有藍(lán)色斑點(diǎn)或者條紋。未出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)可能是因?yàn)橥庠椿驘o(wú)法表達(dá)，也可能是因?yàn)橥庠椿虮磉_(dá)十分微少，亦或葉片脫色后呈褐色狀態(tài)，影響觀察效果。因此，后期需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善實(shí)驗(yàn)條件，增加處理因素，以明確影響桂花和石楠瞬時(shí)表達(dá)效果的原因。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的觀察與分析發(fā)現(xiàn)，攜帶有外源基因的農(nóng)桿菌會(huì)降低石楠和桂花葉片的生理活性，使葉片加速衰敗。用去離子水培養(yǎng)侵染過的石楠和桂花葉片會(huì)比用蔗糖溶液培養(yǎng)的葉片衰敗更快，說明蔗糖可較好保持立體葉片的生理活性。石楠和桂花葉片在用侵染液侵染后的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，石楠相較于桂花更容易受到農(nóng)桿菌液的損傷，葉片細(xì)胞的衰敗更明顯，而桂花雖然也會(huì)受到農(nóng)桿菌液的影響，但影響相對(duì)較小，可能是因?yàn)樗募竟鸬娜~片革質(zhì)和木質(zhì)化程度更高，對(duì)于農(nóng)桿菌液帶來(lái)的損害起到了一定的緩沖作用。在進(jìn)行真空侵染時(shí)也發(fā)現(xiàn)，桂花葉片更難侵入農(nóng)桿菌液。含有GUS基因和含有P19基因的農(nóng)桿菌侵染液都會(huì)加速桂花和石楠葉片衰敗。菌液無(wú)法用GUS染液染出藍(lán)色，只有該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞之后，GUS基因才能表達(dá)。

侵染4 d后的桂花和石楠葉片經(jīng)過無(wú)水乙醇和75%乙醇兩次脫水后無(wú)法用肉眼或者在顯微鏡下觀察到明顯的藍(lán)色斑點(diǎn)或藍(lán)色條紋，原因可能是多方面的：1）GUS基因無(wú)法在桂花和石楠葉片中滿足表達(dá)條件;2）表達(dá)的蛋白質(zhì)微量，無(wú)法用肉眼或者顯微鏡觀察到;3）石楠和四季桂的葉片太厚無(wú)法觀察;4）葉片褐化造成的顏色遮蓋，具體原因還需進(jìn)一步研究。目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)方法已經(jīng)在煙草、擬南芥、萵苣、番茄、草莓、梨等多種植物中得到應(yīng)用。雖然本研究沒有在直觀上檢測(cè)到瞬時(shí)表達(dá)的GUS蛋白表型，但也為后續(xù)其他園林木本植物瞬時(shí)表達(dá)體系提供了一參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李軍，趙愛春，王茜齡，等.桑樹肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子的克隆及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（4）：625-632.

[2] 魏桂民，李德文，羅莉斯，等.馬鈴薯sgt3基因啟動(dòng)子克隆及其功能鑒定[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，51（5）：32-38.

[3] 倪志勇，呂萌，王娟，等.棉花GhCAD6基因表達(dá)載體構(gòu)建及GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（1）：20-24.

[4] 邱礽，陶剛，李奇科，等.農(nóng)桿菌滲入法介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)及應(yīng)用[J].分子植物育種，2009，7（5）：1032-1039.

[5] 楊麗萍，金太成，徐洪偉，等.植物中瞬時(shí)表達(dá)外源基因的新型侵染技術(shù)[J].遺傳，2013，35（1）：111-117.

[6] 劉雪梅，王蕾，文添龍，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立[J].植物學(xué)報(bào)，2014，49（5）：587-594.

[7] 麻鵬達(dá)，周曉馥，秦波，等.Rubisco小亞基基因片段的亞克隆及其瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建[J].分子植物育種，2004（4）：527-530.

[8] 韓林林，李俊華，趙喜亭，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷山藥葉片瞬時(shí)表達(dá)方法的建立[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，44（6）：135-139.

[9] 喬利仙，于新玲，隋炯明，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26（9）：1244-1248，1358.

[10] 陳仲，廖維華，王靜澄，等.影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的因素[J].植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（8）：1126-1134.

（責(zé)任編輯：劉昀）