溫中祛寒三方對急性胰腺炎模型小鼠TRPV1表達的影響

郭蓉　高蔚　殷茵　韓雪珍　陳香云　劉甜甜　吳丹桐　安致君　楊楨　劉珍洪

摘要 目的：探討溫中祛寒的小建中湯、吳茱萸湯和理中丸減輕急性胰腺炎炎性反應和疼痛的作用機制。方法：選取30只雄性小鼠并隨機分為正常組、模型組、小建中湯組、吳茱萸湯組、理中丸組，每組6只。模型組和各給藥組小鼠使用雨蛙素造模。觀察組分別灌胃小建中、吳茱萸湯和理中丸水溶液。正常組和模型組小鼠給予等量雙蒸水灌胃。檢測并比較各組小鼠疼痛行為、血清淀粉酶（AMY）、髓過氧化物酶（MPO）、胰腺病理及胰腺組織中瞬時受體電位香草酸受體1（TRPV1）、NK1R和降鈣素基因相關肽（CGRP）蛋白表達。結果：與模型組比較，小建中湯、吳茱萸湯和理中丸均能延遲小鼠疼痛行為第1次出現時間、降低MPO活性、降低AMY水平，差異有統計學意義（P<0.05），下調TRPV1、NK1R和CGRP蛋白表達，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：溫中祛寒三方減輕急性胰腺炎小鼠模型的炎性反應和疼痛可能是通過下調TRPV1、NK1R和CGRP的表達來實現。

關鍵詞 小建中湯;吳茱萸湯;理中丸;急性胰腺炎;熱敏通道;瞬時受體電位香草酸受體1;神經激肽1受體;降鈣素基因相關肽;作用機制

Effects of 3 Formulas of Warming Spleen and Stomach for Dispelling Cold on the Expression of TRPV1 in Model Mice with Acute Pancreatitis

GUO Rong，GAO Wei，YIN Yin，HAN Xuezhen，CHEN Xiangyun，LIU Tiantian，WU Dantong，AN Zhijun，YANG Zhen，LIU Zhenhong

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism Xiaojianzhong Decoction，Wuzhuyu Decoction and Lizhong Pills in the formulas of warming spleen and stomach for dispelling cold in alleviating inflammation and pain in acute pancreatitis.Methods：A total of 30 male mice were randomly divided into a normal group，a model group，a Xiaojianzhong Decoction group，a Wuzhuyu Decoction group and a Lizhong Pills group，with 6 mice in each group.Mice in the model group and each administration group were modeled with caerulein.Mice in the treatment groups were given intragastric solution of Xiaojianzhong Decoction，Wuzhuyu Decoction and Lizhong Pills respectively.Mice in the normal group and the model group were given the same amount of double distilled water by gavage.The pain behavior，AMY，MPO，protein expression of TRPV1，NK1R and CGRP in pancreatic pathology and tissues of mice in each group were detected and compared.Results：Compared with the model group，Xiaojianzhong Decoction，Wuzhuyu Decoction and Lizhong Pills can delay the first occurrence time of pain behavior in mice，reduce MPO activity ，reduce AMY level （P<0.05），and down-regulate the expression of TRPV1，NK1R and CGRP proteins （P<0.05）.Conclusion：The 3 formulas of warming spleen and stomach for dispelling cold can alleviate inflammation and pain in acute pancreatitis model mice by down-regulating the expression of TRPV1，NK1R and CGRP proteins.

Keywords Xiaojianzhong Decoction; Wuzhuyu Decoction; Lizhong Pills; Acute pancreatitis; Thermal channel; TRPV1; NK1R; CGRP; Mechanism

中圖分類號：R285.5;R576文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.013

急性胰腺炎（Acute Pancreatitis，AP）是胰腺的急性炎性反應，其發病率近些年有明顯的上升趨勢，其中一些患者最終發展為重型急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis，SAP），之后又迅速發展為多器官功能障礙，AP患者發生這種情況的發生率為20%～30%[1]。腹痛常為AP患者的就診原因，嚴重者可發展為急腹征。因此，臨床上減輕患者疼痛的癥狀尤為重要，并且也成為臨床上治療該病效果評價指標之一。迄今為止，西醫還沒有特定的藥物或方法來治療這種疾病。中醫根據其腹痛的辨證要點，將其歸屬到“腹痛”“胃脘痛”等病癥中。《方劑學》溫中祛寒中的小建中湯、吳茱萸湯和理中丸在臨床上主要治療急慢性胰腺炎[2-3]、急慢性膽囊炎[4-5]、急慢性結腸炎[6]、功能性腹痛[7-8]等中焦腹痛病癥，療效顯著。現在普遍認為神經源性炎性反應在急性胰腺炎發展中起重要作用，瞬時受體電位香草酸受體1（TRPV1）通道的激活及后續P物質（SP）和降鈣素基因相關肽（CGRP）在脊髓和外周的釋放量增加在炎性活動和介導疼痛中發揮著重要作用[9]。本研究采用雨蛙素重復腹腔注射誘導急性胰腺炎模型，研究小建中湯、吳茱萸湯和理中丸對小鼠急性胰腺炎胰腺組織TRPV1、神經激肽1受體（NK1R）、SP受體、和CGRP表達的影響，探討三方減輕急性胰腺炎炎性反應和胰腺疼痛效應的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠30只，8周齡（20～25 g），由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[許可證號：SCXK（京）2016-0006]。動物飼養于北京中醫藥大學實驗動物房，動物倫理審批號：BUCM-4-2018010802-1008。

1.1.2 藥物 小建中顆粒劑，湖南康爾佳制藥股份有限公司，15 g/袋，生產批號：170638;吳茱萸湯細粒（日本松浦漢方，生產批號：P6Q4），2 g/包;理中丸[國藥集團馮了性（佛山）藥業有限公司，生產批號：170006]，9 g/丸。

1.1.3 試劑與儀器

雨蛙素（上海源葉生物科技有限公司，貨號：S25157）;兔抗鼠β-action多抗（英國Abcam公司，貨號：ab6276）;兔抗鼠NK1R多抗（美國Novus公司，貨號：NB300-119）;髓過氧化物酶酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（Raybiotech生物公司，批號：20160405）;兔抗鼠CGRP多抗（美國Santa cruz公司，貨號：SC-57053）;免疫組織化學法通用型二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋，貨號：PV-9000）;兔抗鼠TRPV1多抗（美國Proteintech公司，貨號：22686-1-AP）;血清淀粉酶試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號：C016-1）;光學顯微鏡（日本Olympus公司，型號：BX60）;離心機（德國Eppendorf公司，型號：5415D）;Biotek酶標儀450 nm（美國BIO-RAD公司，型號：Elx800）;數字凝膠成像系統（美國ALPHA INNOTECH公司，型號：FLUROCHEM9900-50）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將C57BL/6雄性小鼠30只隨機分為正常組、模型組、小建中湯組、吳茱萸湯組和理中丸組，每組6只，適應性喂養7 d后開始實驗。模型組和各給藥組小鼠雨蛙素按50 μg/kg，100 μL/只/次行腹腔內注射，注射1次/h，共8次。正常組小鼠以等量生理鹽水行腹腔內注射。

1.2.2 給藥方法

給藥分為3次給藥，即在雨蛙素第1次腹腔注射后1 h第1次給藥、雨蛙素第8次注射后1 h第2次給藥、雨蛙素第1次腹腔注射后24 h第3次給藥。根據臨床治療70 kg體質量的患者，每日服用小建中湯、吳茱萸湯和理中丸按照生藥量計分別為45 g、6 g和18 g，根據“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”折算，三方觀察組分別灌胃小建中顆粒，5.85 g/（kg·d）、吳茱萸湯細粒，0.78 g/（kg·d）和理中丸，2.34 g/（kg·d）;正常組和模型組小鼠灌服等量0.9%雙蒸水溶液。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 小鼠疼痛行為觀察 熱板實驗在取材前1 h進行。測試前各組小鼠在測試環境中適應1 h，將熱板溫度調至（55+1）℃，記錄小鼠在30 s內疼痛行為（舔/抬后爪和跳躍）第1次出現時間[10]。

1.2.3.2 血清淀粉酶（AMY）水平、髓過氧化物酶（MPO）活性 各組小鼠注射戊巴比妥鈉麻醉后，小鼠摘眼球取血，離心后取血清用于血清淀粉酶檢測，具體按照試劑盒提供的方法步驟進行。頸椎脫臼法處死小鼠后，剝離胰腺組織保存于-80 ℃冰箱，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測小鼠髓過氧化物酶活性，按照說明書將標準品和樣品加入相應的孔中，用密封膜密封整個板，在4 ℃孵育過夜，之后用PBS沖洗3次，隨后加入生物素標記抗體，并在室溫下培養1 h，PBS沖洗3次。每個反應孔加入HRP-鏈霉親和素室溫孵育45 min后洗滌，每個孔中加入100 μL TMB顯色溶液，在室溫下孵育30 min，最后在每個孔中加入50 L終止溶液，并立即在酶標儀上以450 nm的速度讀取數值。

1.2.3.3 胰腺組織病理 10%甲醛溶液固定的胰腺組織經過脫水、透明并浸蠟，包埋，切片，脫蠟，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片。100倍高倍顯微鏡下攝片。胰腺組織損傷情況表現為胰腺水腫，小葉間隙局限性擴張，胰腺腺泡空泡化及壞死，脂肪組織壞死，間質及血管周圍炎性細胞浸潤等[1]。

1.2.3.4 免疫組織化學法檢測胰腺組織中TRPV1、NK1R和CGRP蛋白 免疫組織化學法檢測，參照相關文獻[11]進行。應用Image Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析，以累積光密度IOD為指標。

1.2.3.5 免疫印跡法檢測胰腺組織中TRPV1、NK1R和CGRP蛋白表達 將-80 ℃冰箱保存的小鼠胰腺組織冰上解凍稱重，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液后離心吸取上清。上清液進行蛋白定量測定后，每組樣本放在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳后轉到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。棄去封閉液加入一抗進行雜交，于4 ℃反應過夜。取出PVDF膜，TBST漂洗4次。加入二抗（1∶1 000稀釋），室溫振搖反應1 h。取出PVDF膜，TBST漂洗4次。將膜放入數字凝膠成像系統中檢測，觀察并拍攝蛋白條帶。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件和Image-Pro Plus 6.0軟件進行數據分析，圖像處理采用Graphpad prism 7.0軟件，組間測量數據比較采用單因素方差分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠疼痛行為比較 與正常組比較，模型組小鼠疼痛行為（舔/抬后爪和跳躍）第1次出現時間明顯縮短，差異有統計學意義（P<0.05），各觀察組小鼠疼痛行為第1次出現時間差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，各觀察組均能延遲小鼠疼痛行為第1次出現時間，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠AMY、MPO水平比較 模型組小鼠血清AMY水平、MPO水平較正常組比較均有明顯上升，差異有統計學意義（P<0.05）;小建中湯組、吳茱萸湯組小鼠血清AMY水平較正常組比較有上升，差異有統計學意義（P<0.05），而理中丸組小鼠血清AMY水平差異無統計學意義（P>0.05）;各給藥組小鼠MPO含量與正常組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，觀察組三方均降低了小鼠血清AMY水平、小鼠MPO水平，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組小鼠胰腺組織HE染色病理變化 正常組小鼠的胰腺組織中胰腺腺泡細胞完整，血管及導管未見炎性細胞等浸潤，小葉間隔正常。模型組胰腺腺泡細胞較正常組比較，水腫、空泡化嚴重，血管周圍紅細胞和炎性細胞浸潤、細胞間隙和小葉間隔擴大明顯增多。與模型組比較，三方觀察組明顯改善胰腺腺泡細胞水腫程度及炎性細胞浸潤程度。見圖1。

2.4 各組小鼠胰腺組織中TRPV1、NK1R和CGRP蛋白表達免疫組織化學法結果比較

正常組小鼠胰腺腺泡之間散在分布TRPV1陽性表達。模型組的胰腺組織中TRPV1陽性表達較正常組比較明顯增高;各觀察組與模型組比較，胰腺腺泡間TRPV1陽性表達均明顯下調。見圖2。在正常組中，小鼠胰腺腺泡細胞散在分布少量的NK1R陽性表達量。與模型組比較，各觀察組胰腺腺泡細胞內NK1R陽性表達下調。見圖3。正常組小鼠胰腺腺泡和血管周圍散在分布CGRP而模型組的胰腺組織中CGRP陽性表達明顯增高。小建中湯、吳茱萸湯和理中丸治療后，與模型組比較，胰腺腺泡和血管周圍的CGRP陽性表達明顯下調。見圖4。

與正常組比較，模型組與各觀察組小鼠胰腺組織中TRPV1、NK1R和CGRP陽性表達明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，小建中湯、吳茱萸湯和理中丸觀察組小鼠胰腺組織中TRPV1、NK1R和CGRP陽性表達均明顯下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.5 各組小鼠胰腺組織中TRPV1、NK1R和CGRP蛋白表達比較

TRPV1各組均在95 kDa處出現條帶;NK1R各組均在46 kDa處出現條帶;CGRP各組均在14 kDa處出現條帶。見圖5。

與正常組比較，模型組、吳茱萸湯組和理中丸組胰腺TRPV1蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）模型組和理中丸組胰腺NK1R蛋白表達升高，差異有統計學意義（P<0.05），模型組胰腺CGRP蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），各觀察組胰腺CGRP蛋白表達降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，各觀察組給藥后胰腺TRPV1、NK1R和CGRP蛋白表達均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

AP的病因和發病機制較為復雜，涉及胰蛋白酶學說、細胞損傷機制、膽道系統疾病、炎性反應遞質和周圍神經損傷等[12-14]。隨著現代社會快節奏的發展，人們的生活水平不斷提高，大量飲酒，暴飲暴食等不健康、不規律的飲食生活習慣越來越多，使得該病的發病率逐年增加，治療越來越棘手，因此，迫切需要更深入地了解和研究AP的病理機制成為開發相應治療藥物的重要基礎。

熱敏通道TRPV1一種非選擇性陽離子通道，自1997年發現至今，研究其在介導炎性反應和疼痛病理機制中發揮重要作用，并且作為相關疾病治療的分子靶點[15-16]。近期研究發現，TRPV1可以在胰腺腺泡之間的神經束和纖維中檢測到[17]。TRPV1通道的激活及后續SP和CGRP在脊髓和外周的釋放量增加可能是介導急性胰腺炎炎性反應和胰腺疼痛的主要作用機制[18]。

SP和CGRP是分布在初級感覺神經元無髓鞘神經元的2個亞群C和Aδ纖維的2種神經遞質。CRRP陽性表達分布在整個胰腺組織包括（胰島和腺泡細胞），特別是腺泡和血管周圍的神經纖維處。SP和CGRP在神經末梢的釋放具有促炎作用，可與內皮細胞、小動脈、肥大細胞和其他免疫細胞相互作用，從而誘導血管擴張、水腫和炎性細胞浸潤等神經源性炎性反應[19]。在胰腺中含SP的神經元較豐富，SP在外周釋放并與內皮細胞和上皮細胞上的NK1R結合而發揮相應作用[20]。NK1R受體位于細胞膜上，當SP與其結合后將陷入細胞內開始細胞內吞作用;而SP降解后，NK1R受體又將重新回到細胞膜表面。雨蛙素造模后，NK1R因內吞作用而顯示胰腺腺泡細胞核深染，細胞內NK1R陽性表達明顯增多。給予速激肽SP與NK1R結合在急性胰腺炎模型小鼠實驗中可誘導高淀粉酶血癥和血漿外滲、水腫和中性粒細胞浸潤等急性胰腺炎早期炎性反應[21]。NK1R藥理學拮抗劑阻斷了此作用，同樣NK1R遺傳缺失減少了小鼠胰腺組織中雨蛙素誘導的血漿外滲和嚴重程度[22]。以上研究證實SP和CGRP釋放增加參與了急性胰腺炎炎性反應病理過程。而SP和CGRP的釋放往往受TRPV1的調控，在相關實驗中，重復使用雨蛙素能夠激活TRPV1通道，導致SP、CGRP釋放，而它們的大量釋放反過來放大炎性聯級反應，進一步加重胰腺炎炎性反應[9]。而使用TRPV1拮抗劑辣椒平可以阻斷上述病理過程，減少SP和CGRP的釋放，降低了雨蛙素誘導的MPO水平的升高和胰腺炎炎性反應組織病理學嚴重程度等，以減輕胰腺炎炎性反應[23]。重復注射雨蛙素誘導的實驗性急性胰腺炎以血清淀粉酶升高、髓過氧化物酶活性增加以及組織病理學變化（胰腺水腫、中性粒細胞浸潤和壞死）作為急性胰腺炎特征性標志。本研究采用此造模方法，結果顯示模型組小鼠AMY水平、MPO活性顯著升高，小鼠胰腺組織胰腺腺泡細胞水腫、空泡化嚴重程度，血管周圍紅細胞和炎性細胞浸潤均明顯增多。同時，TRPV1、NK1R和CGRP蛋白表達在模型組中均明顯上調，與上述文獻中報道的結果一致。

小建中湯、吳茱萸湯和理中丸三方中的藥物包含著多種TRPV1激動劑或拮抗劑，對TRPV1有調控作用。在前期研究中，采用全細胞膜片鉗技術測試了吳茱萸堿、10-姜酚、6-姜腦、姜酮和吳茱萸次堿等有效標志成分，進一步證明了其對TRPV1產生的激活效應[24]。本研究結果顯示，小建中湯、吳茱萸湯和理中丸三方與模型組比較，均能夠有效降低小鼠AMY水平、MPO水平，改善小鼠胰腺組織病理炎性反應程度，下調TRPV1、NK1R和CGRP蛋白的表達。提示三方均可減輕小鼠急性胰腺炎炎性反應，可能的機制與其下調TRPV1而減少SP和CGRP的釋放有關。

急性胰腺炎的患者大多以腹痛為就診原因，嚴重者發展為急腹征。急性胰腺炎疼痛和軀體疼痛不同，它屬于內臟痛，是源于胸腔或腹腔內臟器官發生疼痛的表現。內臟痛分為炎性內臟痛、癌性內臟痛和功能性內臟痛等不同類型，而急性胰腺炎疼痛屬于炎性內臟痛的范疇，多表現為患者疼痛定位不精確。目前，西醫解痙止痛多采用杜冷丁和阿托品聯合治療，但不良反應等明顯。中醫藥在治療中焦病癥方面療效突出，尤其是改善患者疼痛癥狀方面有其特有的優勢。小建中湯、吳茱萸湯和理中丸在治療膽囊炎、痛經、功能性內臟痛等臨床常見病癥頗有療效。

TRPV1介導SP和CGRP在中樞和外周的釋放不僅引起神經源性炎性反應而且介導著胰腺疼痛，阻斷這種神經源性炎性反應疼痛行為出現明顯減輕的趨勢[25]。傷害性感受器有預警作用，當它感受到刺激性傷害時，會以另外一種信號（如疼痛）向中樞傳遞信息，然后產生相應的行為來避免傷害。目前，齲齒動物疼痛研究主要依靠行為學方法，模型動物身上會出現特異性疼痛行為，比如舔爪、撓癢、拉伸、退縮等。既往胰腺疼痛相關實驗中，用L-精氨酸誘導大鼠壞死性胰腺炎發現大鼠腹部疼痛收縮明顯增多，在鞘內注射SP拮抗劑和CGRP拮抗劑后明顯減輕了疼痛等傷害性感受的傳遞，提示SP和CGRP的釋放參與了胰腺疼痛，用TRPV1激動劑辣椒素注射到胰管中可使NK1R內吞作用增加（提示SP釋放增多），而在同一實驗中，通過全身給藥辣椒平能夠使大鼠腹部疼痛收縮顯著降低[12]。因此，拮抗或降低TRPV1受體表達能夠減少SP和CGRP的釋放量而發揮止痛作用。本實驗采用熱板實驗評估小鼠疼痛行為反應，本研究結果顯示三方較模型組比較均使小鼠疼痛行為第1次出現時間延遲，三方較模型組比較明顯降低TRPV1、NK1R和CGRP在蛋白層面的表達。

熱敏通道TRPV1有致敏和脫敏雙重現象，即激動劑可以激活該通道，又可使該通道脫敏，這種作用以劑量依賴方式產生。熱敏通道TRPV1作為傷害性感受器負責傷害性刺激的傳入，三方減輕炎性反應和發揮止痛效應可能是通過下調TRPV1受體及減少SP和CGRP的釋放這一作用來減輕炎性反應和疼痛等傷害感受的感知和傳遞的。可能涉及2種機制，一是使TRPV1通道脫敏，即伴隨時間和濃度的增加，通道由活化狀態反轉為失活狀態;二是對TRPV1通道的抑制作用。TRPA1是寒痛通道，分布的部位與TRPV1大體相似，TRPV1和TRPA1在痛覺感覺神經通路中可相互影響而產生疼痛積分效應[26]。在急性胰腺炎相關研究中證實給予TRPV1和TRPA1拮抗劑聯合運用可減輕雨蛙素誘導的胰腺炎炎性反應和疼痛，兩者具有協同作用[27]。小建中湯中主要藥物桂枝的有效成分桂皮醛是TRPA1的激動劑[28]，生姜的有效成分6-姜酚、姜腦等是TRPV1的激動劑[11]，那么有一種可能性不能排除，即小建中湯對急性胰腺的消炎、止痛效果，可能是其作用于TRPV1和TRPA1產生的協同作用。

綜上所述，小建中湯、吳茱萸湯和理中丸三方可明顯減輕雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎炎性反應和延遲胰腺疼痛出現時間，其可能的作用機制是下調TRPV1（脫敏或抑制TRPV1通道），減少SP和CGRP的釋放而實現的。這為三方臨床上用于AP的治療提供了一定理論依據。

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（2019-07-26收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81573847）作者簡介：郭蓉（1993.01—），女，碩士研究生在讀，研究方向：方劑作用機制、中醫四氣五味學，E-mail：gr1113215159@163.com通信作者：楊楨（1964.10—），男，博士，教授;研究方向：中醫四氣五味學，E-mail：yangz@bucm.com.cn;劉珍洪（1990.06—），女，博士研究生在讀，研究方向：中醫四氣五味學，E-mail：lzhh0399@163.com