高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法測定海藻中5種砷形態

陳露，嵇晶，金佳穎，鄭麗杰，韓威，王欣之,3*，劉睿,3，吳皓,3*

1(南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京， 210023) 2(江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發重點實驗室，江蘇 南京， 210023)3(江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京， 210023)

海藻是我國出口創匯的重要海產品，深受國內外消費者的喜愛，含有豐富的碘、膳食纖維、蛋白質、多糖、多酚、甾醇等營養物質和活性物質[1-3]，具有潛在的經濟開發價值[4-6]。海藻由于細胞壁的多孔結構及自身機制極易富集水中的砷，被稱為海洋生態系統的“砷庫”。砷在自然界存在著不同的形態，毒性由大到小依次為：亞砷酸根(As3+)>砷酸根(As5+)>一甲基砷(monomethylated arsenic,MMA)>二甲基砷(dimethylated arsenic,DMA)>砷甜菜堿(arsenobetaine,AsB)[7]，無機砷毒性(As3+和As5+)大于有機砷(MMA和DMA)，AsB則無毒[8]。因此分析海藻中砷的存在形式及有機砷、無機砷的比例，是評價海藻是否可食用或藥用的重要參照依據。

目前砷形態的分析技術有很多[9-12]，高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)具有檢出限低、靈敏度高和線性范圍寬的優勢，已成為目前最常用且有效的方法之一，被廣泛應用于不同基質[13-16]的砷形態分析。在分析前需對樣品進行提取，常用提取方法為水[17]、不同比例的甲醇-水[18]、鹽酸[19]、硝酸[20]、酶試劑[21]等提取液結合超聲提取、微波消解、熱浸提等方法，對不同的樣品選擇合適的提取方式,保證較高的提取率。不同的方法均有優缺點，如酶解法適合蛋白質含量較高的肉類；甲醇提取法若濃度過高會降低儀器的使用壽命；鹽酸中的Cl與Ar形成40Ar35Cl 從而干擾75As的測定[22],因此選擇合適的提取方法是實驗成功的關鍵。

本研究采用HPLC-ICP-MS技術以銅藻中5種形態砷的提取量及總砷提取率為指標,對比GB 5009.11—2014[23]及GB/T 23372—2009[24]中規定的試樣提取方法，對提取劑濃度、溫度進行優化，并將優化得到的方法對不同海藻(海帶、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻)進行分析，以期為海藻的食用安全、品質把控及標準制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

各海藻信息如表1所示。亞砷酸根(As3+)溶液標準物質(GBW08666)、二甲基砷(DMA)溶液標準物質(GBW08669)、一甲基砷(MMA)溶液標準物質(GBW08668)、砷酸根(As5+)溶液標準物質(GBW08667)、砷甜菜堿(AsB)溶液標準物質(GBW08670),中國計量科學研究院；甲醇(色譜級),美國天地；HNO3、NH4H2POm4(優級純)，國藥集團化學試劑有限公司；其他提取用試劑均為國產優級純。

MARS微波消解儀，美國CFM公司；NEXIOH 350D電感耦合等離子體質譜儀、Series 200高效液相，美國Perkin Elmer公司。

表1 藻樣品的采集海域、日期及來源Table 1 Sea area,date and source of seaweed samples

1.2 儀器條件

色譜柱為Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)陰離子交換色譜柱。體積流量1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量50 μL；流動相A：25 mmol/L NH4H2PO4溶液(氨水調至pH=8)；流動相B：水；梯度洗脫：0～15 min，100%～0%水；16～19 min，0%～100%水；20～24 min，100%水。

ICP-MS條件：高頻等離子體發射功率，1 550 W；載氣為高純氬氣；同心霧化器；載氣流速0.85 L/min；氣補償氣流量0.15 L/min；采樣深度9.5 mm；采集75As；蠕動泵轉速0.3 r/min。

1.3 標準溶液的配制

分別精密稱取AsB、As3+、DMA、MMA、As5+標準溶液適量，加水配制成1 000 ng/mL (以砷計)的標準儲備液。精密吸取標準儲備液適量，加水配制成一系列梯度濃度(均以砷計)的混合標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 總砷的測定方法

按照GB 5009.268—2016中[25]規定的“第一法 電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)”進行檢測。

1.4.2 海藻樣品砷形態分析

硝酸-熱浸提：按GB 5009.11—2014[23]中規定的“試樣提取”方法對銅藻進行處理后，進HPLC-ICP-MS檢測。

水-超聲提取：按GB/T 23372—2009[24]中規定的“植物性固體樣品”提取方法對銅藻進行處理后，進HPLC-ICP-MS檢測。

優化后提取方法：取適量海藻樣品，加入20倍體積0.30 mol/L硝酸，在100 ℃恒溫箱內浸提2.5 h，每隔0.5 h取出振蕩1 min，冷卻至室溫，在8 000 r/min下離心15 min，取上清液過0.45 μm有機濾膜，進HPLC-ICP-MS測定。

1.5 數據分析處理

數據采用SPSS 22.0軟件進行分析，數據先進行正態分布檢驗和方差極性檢驗，符合兩者檢驗的數據進行單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗；不符合則采用Kruskal-Wallis 多重比較。

2 結果與分析

2.1 銅藻中總砷的含量

通過ICP-MS對10個海藻樣品中總砷含量進行測定，結果見表2，不同海藻對于砷的富集量有顯著差異，各個海藻中總砷的含量均超出GB 2762—2017《食品中污染物限量》[26]中規定總砷最高允許限量(0.5 mg/kg)的40～200倍。不同海域同種海藻之間總砷含量存在顯著性差異，如鼠尾藻(S)、裙帶菜(Q)，可能與不同海域受污染程度不同有關；同個海域不同采收時間的海藻中的總砷含量也存在顯著性差異，如海帶(H)、裙帶菜(Q1,Q3)，可能與海藻在海水中富集砷的時間長短有關。海藻易富集海水中的砷，砷具有多種不同的形態，若用總砷評價海藻的食用安全顯得十分局限，所以有必要對海藻中砷形態進行分離，確定有機砷及無機砷的比例，從而為評價海藻的食用安全提供依據。

表2 不同海藻中總砷含量的測定 單位：mg/kg

2.2 提取方法的選擇

本文對比分析GB 5009.11—2014中規定的硝酸-熱浸提法和GB/T 23372—2009中規定的水-超聲提取法對銅藻中5種形態砷的提取量的影響，結果如表3所示。

表3 不同提取方法對銅藻中5種形態砷提取量的影響

由表3可知，硝酸-熱浸提對銅藻中5種形態砷的提取總量為56.61 mg/kg，其提取率達71.19%，而水-超聲提取法對應的提取率僅為40.87%；硝酸-熱浸提法能提取得到各種砷形態，而水-超聲法不能提取得到As3+；硝酸-熱浸提所提取的AsB、As3、As5+含量均明顯高于水-超聲提取法。綜合考慮，選用硝酸-熱浸提法作為海藻砷形態分析的提取方法。

2.3 提取條件優化

2.3.1 最佳提取溫度的確定

在HNO3濃度為0.15 mol/L時，考察提取溫度分別為70、80、90、100 ℃對銅藻中5種形態砷提取量的影響，結果表4所示。由表4可知，隨著提取溫度的升高銅藻中總砷的提取率呈上升的趨勢，100 ℃時提取率達最大為74.71%； 銅藻中DMA、MMA含量較低，當提取溫度為70、80 ℃ 時，不能提取得到MMA，DMA提取量隨提取溫度的升高其變化趨勢不明顯，As5+提取量受提取溫度的影響不明顯；AsB和As3+的提取量隨提取溫度增加呈上升的趨勢，當提取溫度達100 ℃時，與70 ℃相比AsB、As3+提取量分別上升了53.08%、66.26%。因此本實驗確定最佳提取溫度為100 ℃。

表4 不同提取溫度對銅藻中5種形態砷提取量的影響

2.3.2 最佳硝酸濃度的確定

在提取溫度為90 ℃，考察濃度分別為0、0.15、0.30、0.45 mol/L的硝酸溶液對銅藻中5種形態砷提取量的影響，結果如表5所示。

表5 不同硝酸濃度對銅藻中5種形態砷提取量的影響

由表5可知，隨著提取液濃度的增加，銅藻中總砷的提取率呈先上升后降低的趨勢；當HNO3濃度為0.30 mol/L時，總砷提取率最高為86.09%，且在該濃度下，AsB、As3+、MMA提取量均最高；DMA提取量整體變化趨勢均不明顯，As5+的提取量隨濃度的升高而增加；在HNO3濃度為0.45 mol/L時,As3+的提取量降低，而As5+的提取量上升，可能是HNO3濃度過高使低價的As3+氧化為高價態的As5+；綜上,選擇HNO3溶液濃度為0.3 mol/L為最佳濃度。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察

將一系列不同質量濃度的5種形態砷的混合標準溶液，按上述色譜條件取50 μL進HPLC-ICP-MS分析，測定結果以各形態砷的質量濃度為橫坐標X，以響應值為縱坐標Y，繪制標準曲線，回歸方程見表6。

表6 五種形態砷的線性范圍、回歸方程、相關系數Table 6 Linear ranges,regression equations andcorrelation coefficients of the five arsenic species

2.4.2 精密度、重復性及加標回收率考察

取質量濃度為100 ng/mL各形態砷混合標準溶液連續在HPLC上進樣6次，計算RSD值,AsB、As3+、DMA、MMA、As5+的RSD分別為1.56%、2.22%、1.58%、1.60%、5.79%。取適量銅藻粉末，按硝酸-熱浸提的提取條件進行處理，共6份，進HPLC分析，計算RSD值，AsB、As3+、DMA、MMA、As5+的RSD分別為3.74%、8.42%、12.64%、8.86%、2.66%。取銅藻樣品6份，分別加入砷標準混合溶液適量，按優化后的提取條件進行處理，計算加標回收率，5種形態砷的平均回收率為79.50%～115.73%，RSD均低于15%。

2.5 海藻中5種形態砷含量測定

按優化后的方法對不同海藻中5種形態砷含量進行測定，結果如表7所示。5種海藻中DMA、MMA含量均較低，毒性較大的無機砷在5種海藻中占比各有不同。T1銅藻中以As5+含量最高，無毒性的AsB次之，DMA含量最低，其中無機砷占總砷含量的58.39%，僅次于Y1羊棲菜。海帶(H)、裙帶菜(Q)中無機砷占比較低，約占總砷含量的15%，主要以無毒性的AsB形式存在，這與常家琪[27]、高繼慶[28]的研究一致；Q2裙帶菜中無機砷的占比低于T1銅藻及Y1羊棲菜(P<0.05)；Y1羊棲菜中AsB的占比低于Q2裙帶菜及H1海帶(P<0.05)；羊棲菜(Y)砷主要以毒性較大的無機砷形式存在，占提取總砷的50%～60%，與文獻研究[29-30]一致；鼠尾藻中無機砷約占提取總砷的40%。按我國現行農業行業標準NY/T 1709—2011《綠色食品 藻類及其制品》[31]中規定藻類中無機砷限量應≤1.5 mg/kg，則所測的海藻樣品中無機砷含量均超標，其中銅藻、羊棲菜、鼠尾藻嚴重超標，海帶、裙帶菜超標量較少。

表7 不同海藻中5種形態砷的含量測定

100 ng/mL的5種形態砷混合標準溶液(A)，銅藻(T1)、海帶(H2)、鼠尾藻(S1)、羊棲菜(Y1)、裙帶菜(Q3)的色譜圖見圖1。從圖1可知，各形態砷峰形尖銳且能完全分離，靈敏度較高，說明該方法滿足海藻砷形態分析的要求。

1-AsB；2-As3+；3-DMA；4-MMA；5-As5+圖1 100 ng/mL混合標準溶液(A)及編號為T1、H2、S1、Y1、Q3海藻中5種砷形態色譜圖Fig.1 Chromatograms of the five arsenic species in 100 ng/mL mixed standard solution (A) and T1,H2,S1,Y1,Q3 seaweed

3 結論與討論

本研究建立了海藻中AsB、As3+、DMA、MMA和As5+等5種砷形態分析測定的HPLC-ICP-MS方法，并進行優化，確定以0.3 mol/L硝酸溶液為提取劑，樣品在提取溫度為100 ℃條件下提取為最優條件，該提取方法操作簡便、快捷，總砷提取率較高；用所建立的分析方法對銅藻、海帶、裙帶菜、鼠尾藻、羊棲菜進行分析。結果表明，銅藻中以As5+含量最高，無毒性的AsB含量次之，DMA含量最低，其中毒性大的無機砷占提取總砷含量的58.39%；海帶、裙帶菜中砷化合物主要以無毒性的AsB形式存在；羊棲菜、鼠尾藻中無機砷占比分別約為50%～70%、40%；各海藻中毒性大的無機砷均超過NY/T 1709—2011《綠色食品 藻類及其制品》中規定的最高允許限量，其中銅藻、羊棲菜、鼠尾藻超標嚴重。

海藻中無機砷超標嚴重，其食用安全性引起消費者的關注。但目前對攝入海藻后不同形態砷化合物在體內代謝途徑的探討不夠深入，且對海藻無機砷的風險評估還不完善，后續應對砷化合物的毒理學評價及風險分析進行深入研究，同時加強對海藻中無機砷含量的監測，為科學指導海藻的食用安全提供依據。