乙型肝炎病毒大蛋白檢測在慢性乙型肝炎診療中的臨床意義*

胡海石 董 博 王德景 蘇亞娟 杜文功

1.廊坊市人民醫院檢驗科 （河北 廊坊，065000） 2.廊坊市開發區人民醫院檢驗科 3.廊坊市中心血站檢驗科

慢性乙型肝炎（CHB）的發病人群較廣，流行病學研究證實，CHB的發病率可達483～686／1萬人［1］。特別是在部分流行區，CHB的發病率可進一步上升［2］。在CHB的病情檢測指標方面，部分研究者認為乙型肝炎病毒大蛋白（HBV LP）的表達能夠評估患者的感染程度，HBV LP能夠通過激活上游基因的轉錄速度，提高啟動子的轉錄活性，進而影響到HBV DNA的擴增過程［3］。同時相關基礎方面的研究還認為，HBV LP的上升能夠提高HBV突變的風險，導致病毒耐藥或者臨床治療結局的惡化［4］。部分研究者報道了HBV LP的表達及其與CHB患者治療結局的關系，認為HBV LP在評估HBV感染或者預后的過程中能夠發揮一定的作用［5］，但缺乏HBV LP與HBV DNA的對照分析。本研究探討了HBV LP的表達及其與HBV DNA的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年1月在廊坊市人民醫院治療的CHB患者89例，其中男59例，女30例；年齡36～67歲，平均（51.20±8.19）歲；病程9個月～16年，平均病程（8.39±2.01）年。納入標準：①符合中華醫學會制定的CHB診斷標準的患者［6］；②未合并其他肝炎病毒感染者；③初治患者；④患者及家屬知情同意。排除標準：合并有惡性腫瘤者；有肝臟手術史者。

1.2 治療方法 患者口服恩替卡韋（國藥準字H20052237，正大藥業有限公司），0.5 mg，1次／d，連續3個月。治療過程中，對于丙氨酸氨基轉移酶（ALT）或者天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）大于40 U／L的患者給予肝蘇顆粒或者飛利肝片保肝治療。

1.3 檢測方法 HBV DNA定量檢測：采集患者的血清5 ml，加入0.2m l的氯仿，2～8℃離心（12 000 g／min，15min），反復洗滌RNA，棄上清液，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入1 ml 75% 乙醇，0.1% DEPC水溶解。加入HBV基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為20 pmol／μl，制備反應體系。RT-PCR 擴增條件與參數：48℃，45 min，94℃，2 min；94℃30 s，58℃60 s，68℃2 min，共40個循環；循環完畢后68℃延伸7 min。采集患者的靜脈血3 ml，加入HBV LP單抗，標本和標準品中的HBV LP會與單抗結合，PBS液體洗滌5 min。按照1∶500的比例加入羊標志的一抗5 m l，4℃放置過夜，PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，加入鼠來源的二抗（1∶1 000）2 ml，室溫放置2 h，PBS液體洗滌5 min。加入顯色底物，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值。

1.4 判斷標準 HBV DNA陽性標準：病毒載量≥103拷貝／ml為陽性。HBV LP陽性標準：吸光度值≥0.105時為陽性。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0進行統計分析，計量資料采用±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料比較使用χ2檢驗；相關性采用Pearson相關分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHB患者HBV LP、HBV DNA檢測情況 CHB患者HBV LP陽性率89.89%（80／89），明顯高于HBV DNA的陽性率78.65%（70／89），差異有統計學意義（χ2＝4.238，P＜0.05）。

2.2 CHB患者HBV LP與HBV DNA的關系 隨著HBV DNA拷貝數對數值增加，HBV LP吸光度值明顯升高，其中HBV DNA拷貝數對數值＞7的患者HBV LP吸光度值明顯高于其他患者（P＜0.05），見表1。相關性分析顯示，HBV LP吸光度值與HBV DNA拷貝數對數值呈正相關（r＝0.846，P＜0.05），見圖1。

圖1 HBV LP與HBV DNA的相關性

2.3 CHB患者治療后HBV LP、HBV DNA陽性率情況 70例HBV DNA陽性患者給予抗病毒治療。治療24周時，HBV DNA和HBV LP陽性率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；治療48周時，HBV LP陽性率為48.57%，明顯高于HBV DNA的陽性率（P＜0.05）。見表2。

表2 CHB患者治療后HBV LP、HBV DNA陽性率比較 ［n（%）］

3 討論

性接觸、血源性感染等均能夠增加HBV的感染風險，導致遠期肝功能損害，增加肝臟纖維化的發生風險，特別是在合并有自身免疫力下降的人群中，CHB感染的風險可進一步的上升［7］。長期的臨床隨訪研究發現，CHB感染后的病情遷延不愈的風險較高，疾病容易反復波動。現階段臨床上主要通過HBV DNA來評估患者體內病毒復制情況，判斷抗病毒治療終點。但單純依靠HBV DNA指導CHB治療的準確性較低，其評估停藥時機的靈敏度不足45%［8］。部分患者在HBV DNA轉陰、乙肝病毒表面抗原轉陰后，病情仍然存在持續性進展的潛在風險，部分患者體內的乙肝病毒仍然存在低水平的復制［9］。

HBV表面抗原大蛋白前S區HBV LP的轉錄水平的差異，能夠顯著影響到下游DNA的擴增或者復制過程。過度轉錄的HBV LP能夠通過其對啟動子羧基末端的磷酸化修飾作用，進而提高轉錄區域啟動子的轉錄活性，促進HBV DNA的過度釋放。HBV LP能夠通過其雙跨膜蛋白的重組結構，通過反式調節機制，誘導HBV進入宿主細胞，激活宿主細胞膜內的蛋白激酶C系統，導致HBV DNA的持續性擴增［10］。基礎方面的研究還認為，HBV LP的表達濃度的上升還能夠參與到HBV Dane顆粒的組裝和釋放，參與肝臟上皮細胞膜完整性的破壞［11］。部分研究者已經探討了HBV LP的表達與CHB患者的病情關系，認為HBV LP的表達上升與CHB患者的肝功能惡化密切相關［12］。

本研究發現CHB患者HBV LP陽性率明顯高于HBV DNA陽性率，提示在CHB患者體內HBV LP的表達濃度可進一步上升，同時也提示HBV LP的表達同樣也可能參與CHB患者的病情進展。HBV LP的表達上升主要通過下列途徑影響病情進展［13，14］。①HBV LP的上升能夠提高Dane病毒顆粒與宿主細胞整合效果，導致肝臟上皮細胞線粒體損傷程度的增加；②HBV LP的上升能夠激活HBV DNA的上游轉錄過程，提高HBV DNA的正向擴增調控水平。張蘇貞等［15］也探討了不同病情的CHB患者血清學資料，發現HBV LP的表達陽性率可達75%以上，特別是早初次發病或者處于治療后病毒復制穩定期的患者，HBV LP的表達陽性率可進一步上升。HBV DNA拷貝數量大于7的患者，血清HBV LP水平可進一步上升，同時HBV LP與HBV DNA的表達具有顯著的相關關系，提示二者在促進CHB病情進展過程中可能發揮了重要協同作用。從原因上分析，這主要考慮與HBV LP的上調增加了HBV DNA的轉錄效能，導致上游C區基因轉錄調控水平的增強，從而增加了HBV DNA的拷貝速度。但部分研究者并不認為HBV LP與HBV DNA的表達具有普遍性，認為只有在合并有明顯的CHB活動期表現的患者中，二者的表達才具有顯著的線性關系，可能與HBV LP的檢測靈敏程度、CHB患者的基礎性病情差異較大有關。在治療隨訪的過程中，雖然在治療24周左右并未發現HBV LP與HBV DNA的表達差異，但隨著隨訪時間的延長，可以發現HBV LP的表達陽性率明顯高于HBV DNA，提示HBV DNA維持低水平時，HBV LP的陽性率仍然較高，此時的HBV LP檢測仍然具有較高的臨床指導價值。