非酒精性脂肪性肝病患者血清維生素D水平及其受體基因Bsm I位點(diǎn)多態(tài)性分析

胡 巒 李 艷 鐘偉傳 李鎮(zhèn)武

1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院全科門診 （廣東 深圳，518109） 2.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）全球發(fā)病率約為25.24%，且隨著生活水平的不斷提高及飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的改變，發(fā)病率呈上升且逐漸年輕化的趨勢(shì)［1-3］。NAFLD是一種可逆性肝病，若能早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療，可預(yù)防甚至控制NAFLD的發(fā)生或發(fā)展［4-6］。NAFLD病因十分復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，診斷金標(biāo)準(zhǔn)是肝穿刺活檢，但創(chuàng)傷性強(qiáng)，不利于病情隨訪及療效的判斷［7］。因此，闡明NAFLD發(fā)病機(jī)制及尋找特異性臨床診斷標(biāo)記物，對(duì)NAFLD早期診斷、病情評(píng)估、療效判斷及預(yù)防具有重要意義。本研究對(duì)NAFLD患者和健康人群血清25-羥維生素D3［25-（OH）VitD3］水平及其受體（VDR）基因Bsm I位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行了調(diào)查，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年3月至2019年6月來我院就診并確診為NAFLD的患者132例，其中男87例，女45例；年齡21～63歲，平均（37.52±13.27）歲；其中輕度69例、中度42例、重度21例。同時(shí)選擇健康人群120例，其中男80例，女40例；年齡20～65歲，平均（36.23±11.97）歲。兩組均排除高血壓、高血脂、糖尿病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、藥物性肝炎、肝硬化、腎功能不全、心腦血管疾病、肝功能異常及長(zhǎng)期每日飲酒量乙醇量男性＞80 g、女性＞40 g者，并確保兩組患者的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)同醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)，并經(jīng)同患者及家屬知情同意，簽定知情同意書。

1.2 NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)及嚴(yán)重程度判斷 參照2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)組分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組編著的《NAFLD診療指南》［8］。根據(jù)肝臟多普勒彩色超聲結(jié)果判斷NAFLD病情嚴(yán)重程度［9，10］：①肝區(qū)近場(chǎng)回聲彌漫性增強(qiáng)（強(qiáng)于腎臟與脾臟），遠(yuǎn)場(chǎng)回聲逐漸衰減；②肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)顯示不清；③肝臟輕至中度腫大，邊緣角圓鈍；④肝內(nèi)彩色血流信號(hào)減少或不易顯示，但肝內(nèi)血管走向正常；⑤肝右葉包膜及橫幅回聲顯示不清或不完整。具有①項(xiàng)和②～④項(xiàng)中任何一項(xiàng)者為輕度脂肪肝，具有①項(xiàng)和②～④項(xiàng)中任何兩項(xiàng)者為中度脂肪肝，具有①項(xiàng)和②～④項(xiàng)中任何兩項(xiàng)及⑤項(xiàng)者為重度脂肪肝。

1.3 儀器與試劑 c8000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀、試劑、校準(zhǔn)品及室內(nèi)質(zhì)控品均由美國雅培公司提供；ABI7500 PCR基因擴(kuò)增儀由美國ABI公司提供；DNA提取試劑由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供；25-（OH）VitD3試劑盒由索靈診斷醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象均于清晨空腹采集4～5 ml靜脈血，其中2 ml加入EDTA-K2抗凝管內(nèi)混勻用于全血DNA提取用，剩余的加入一次性無抗凝劑的干燥管內(nèi)，室溫靜置30 min后于離心分離血清，用于25-（OH）VitD3檢測(cè)。

1.4.2 25-（OH）VitD3水平測(cè)定 25-（OH）VitD3采用c8000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行檢測(cè)，所有操作均嚴(yán)格按照c8000分析儀和試劑說明書及科室內(nèi)SOP操作規(guī)程進(jìn)行。

1.4.3 全血DNA提取 采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒提取全血中DNA，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說明書進(jìn)行，提取后采用紫外分光光度儀檢測(cè)其濃度和純度，合格后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 VDR基因Bsm I位點(diǎn)多態(tài)性分析 ①引物設(shè)計(jì)：上游引物5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′，下游引物5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′。②RCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為30μl，其中DNA模板4.5μl，10μmol／L上、下游引物各1.5μl，2×Taq PCR Mix 15μl，去離子水7.5μl。③PCR擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性2min，然后以94°C變性30 s→60°C退火30 s→72°C延伸1 min，循環(huán)35次，最后72°C延伸2 min。④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：取PCR產(chǎn)物10μl，加入Bsm I快速內(nèi)切酶1μl，10×FastDigest Buffer2μl，去離子水17μl，37°C水浴5 min進(jìn)行酶切，65°C水浴5 min終止反應(yīng)。然后將酶切產(chǎn)物加入2%的瓊脂糖凝膠電泳，于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶。⑤判斷標(biāo)準(zhǔn)：于650bp和175bp處同時(shí)出現(xiàn)2條帶的為bb基因型，僅于825bp處出現(xiàn)—條帶的為BB基因型，于825bp、650bp和175bp處出現(xiàn)3條帶的為Bb基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種人群血清25-（OH）VitD3水平比較 NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平為（31.75±9.64）nmol／L，明顯低于健康對(duì)照組的（60.58±16.93）nmol／L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.8254，P＜0.05）。

2.2 不同程度NAFLD患者血清25-（OH）VitD3水平比較 重度NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平為（18.15±4.94）nmol／L，明顯低于中度的（29.01±5.73）nmol／L和輕度的（39.56±12.07）nmol／L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.9752～4.0852，P＜0.05），且25-（OH）VitD3水平隨NAFLD病情的加重而逐步降低，經(jīng)Spearman分析，兩者呈正相關(guān)（r＝0.7902，P＜0.05）。

2.3 兩種人群VDR基因Bsm I位點(diǎn)多態(tài)性比較 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，VDR基因Bsm I位點(diǎn)分別于825 bp、650 bp及175 bp處顯色檢出BB、Bb及bb 3種基因型帶，結(jié)果見圖1，見表1。

1、4為BB基因型；2、6為bb基因型；3、5為Bb基因型；M為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物

表1 兩種人群VDR基因Bsm I位點(diǎn)基因型及等位基因檢出率比較 ［n（%）］

2.4 不同基因型NAFLD患者血清25-（OH）VitD3水平比較 攜帶VDR基因Bsm I位點(diǎn)bb基因型的NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3為（18.62±5.16）nmol／L，明顯低于BB和Bb基因型的（43.29±12.84）nmol／L和（34.05±11.27）nmol／L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.2193～4.0264，P＜0.05）。

3 討論

NAFLD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，研究表明，NAFLD的發(fā)生和發(fā)展與胰島素抵抗、脂質(zhì)氧化、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂、免疫反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)毒素及基因多態(tài)性等諸多因素有密切關(guān)系，其中基因多態(tài)性突變?cè)贜AFLD 發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［11，12］。因此，探索NAFLD患者基因多態(tài)性突變對(duì)預(yù)防、治療、降低并發(fā)癥及病死率至關(guān)重要。

維生素D是一種具有激素樣作用的脂溶性類固醇物質(zhì)，主要通過食物攝入或／和紫外線照射下皮膚合成兩種途徑獲取［13］。維生素D除了調(diào)節(jié)鈣、磷代謝外，還參與糖脂代謝、胰島素合成和分泌、炎性反應(yīng)、免疫及腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。25-（OH）VitD3是維生素D的主要存在形式，其含量的高低直接反映人體維生素D儲(chǔ)存水平。有研究表明，NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平明顯下降，且與NAFLD病情嚴(yán)重程度成正相關(guān)［7］。本研究結(jié)果顯示，NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且與病變程度呈正相關(guān)，與何周桃等［7］及俞媛潔等［14］報(bào)道一致，這可能與25-（OH）VitD3水平降低引起體內(nèi)糖脂代謝紊亂，使大量脂肪在肝細(xì)胞中沉積及脂肪酸氧化作用受抑等有關(guān)。

VDR是一種重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，其基因位于12q13，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，存在多個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在人體內(nèi)分布廣泛，可以通過對(duì)25-（OH）VitD3產(chǎn)生介導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)一步發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，能夠維持骨代謝、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化及內(nèi)分泌平衡［15-17］。有研究表明，VDR基因Bsm I位點(diǎn)多態(tài)性發(fā)生基因突變能影響人體內(nèi)25-（OH）VitD3的合成和分泌，導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)代謝和內(nèi)分泌紊亂，與多種疾病如骨質(zhì)疏松癥、結(jié)核病、前列腺癌、牙周炎及NAFLD等的遺傳易感性有關(guān)［18-21］。本研究結(jié)果顯示，NAFLD患者血清中VDR基因Bsm I位點(diǎn)的bb基因型和b等位基因檢出率明顯高于健康對(duì)照組，與何周桃等［7］報(bào)道一致。且攜帶bb基因型的NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平明顯低于其他基因型，這表明了VDR基因Bsm I位點(diǎn)多態(tài)性突變與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，其中bb基因型可能是本地區(qū)NAFLD發(fā)病的危險(xiǎn)易感基因之一，這可能與VDR基因Bsm I位點(diǎn)的bb基因型通過影響VDR mRNA的轉(zhuǎn)錄，抑制25-（OH）VitD3合成、分泌及其功能有關(guān)。

綜上所述，NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平明顯下降，并隨著病情加重而降低，與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。VDR基因Bsm I位點(diǎn)多態(tài)性突變與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展中有關(guān)，其中bb基因型可能是引起NAFLD發(fā)病的危險(xiǎn)易感基因之一，但不同地區(qū)和種族人群的遺傳基因突變因遺傳背景、生活方式及環(huán)境等諸多因素的不同而存在一定的差異。因此，加強(qiáng)VDR基因Bsm I位點(diǎn)多態(tài)性突變調(diào)查分析，對(duì)診斷、治療及預(yù)防NAFLD有重要意義。