扶正消瘤顆粒對HepG2肝癌裸鼠模型的影響*

王 磊 趙 強 陳曉琦 張傳雷 王新亭 陳欣菊△

1.河南中醫藥大學第一臨床醫學院 （河南 鄭州，450046） 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率居全國惡性腫瘤第4位，死亡率則高居全國惡性腫瘤第2位［1］。遺傳因素、慢性病毒感染、非酒精性脂肪性肝病、吸煙以及飲酒等均可導致肝癌的發生和進展，但誘發肝癌的確切分子機制仍然未知［2］。目前，肝癌的局部治療包括肝切除術、肝移植術、局部消融治療、肝動脈介入治療和放射性核素免疫治療等，然而肝癌是一種高度耐藥且難以治療的癌癥，現有的治療手段不能滿足醫療需求，迫切需要發現新的分子生物標志物和治療靶點，以制定更加精確的醫療策略［3］。成纖維細胞生長因子受體4（FGFR4）屬于受體酪氨酸激酶（RTKs）家族，過表達的FGFR4通過激活多個下游信號通路，調控細胞的生存、增殖、侵襲和遷移等，誘發肝癌［4］。靶向FGFR4信號通路成為一種治療肝癌的新策略。近年來，中醫藥在肝癌的手術和放療后的輔助治療中凸顯了獨特的優勢［5］。扶正消瘤顆粒是河南中醫藥大學第一附屬醫院肝病診療中心協定處方，前期研究發現，扶正消瘤顆粒含藥血清可誘導肝癌HepG2細胞凋亡［6］，但其體內的抗癌藥效研究及相關機制尚不明確。因此，本研究通過建立HepG2裸鼠肝癌移植瘤模型，探討扶正消瘤顆粒在體內抑瘤活性，以及對FGFR4、MMP2、Cyclin D1和Bcl-xL表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡SPF級雌性BALB／c裸鼠10只，體質量16～18g，購自北京維通利華實驗動物公司，飼養于河南中醫藥研究院動物房，標準飼料飼喂，每日光照和黑暗交替各12小時。

1.2 細胞株 人肝癌HepG2細胞株由鄭州大學醫學科學院提供。

1.3 藥品及試劑 扶正消瘤顆粒（FZXLG，含黃芪、黨參、菝葜、鱉甲、牡蠣等藥味）購自江陰天江藥業有限公司；谷丙轉氨酶（ALT，Cat.No.C009-1）、谷草轉氨酶（AST，Cat.No.C010-1）、白蛋白（Alb，Cat.No.A028-2-1）以及甲胎蛋白（AFP，Cat.No.E014-1-1）測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠多克隆抗體FGFR4（Lot.No.E-AB-19391）、MMP2（Lot.No.GB11130）、Cyclin D1（Lot.No.BM1583）以及Bcl-xL（Lot.No.GTX100064）均購自Genetex公司；PBS緩沖液（Lot.No.G0002）、BSA（Lot.No.G5001）、蘇木素染液（Lot.No.G1004）、中性樹膠（Lot.No.G1403）、二 抗HRP標 記 山 羊 抗 兔IgG（Lot.No.GB23303）、DAB顯色劑（Lot.No.G1211）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；高糖DMEM培養基（Lot.No.0033617）、胰酶（Lot.No.0010218）購自Biological Industries公司；胎牛血清（Lot.No.42Q7380K）、RIPA裂解液（Lot.No.N653）分別購自Gibco公司和VWR公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養 HepG2細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清和100 U／mL雙抗的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2的培養箱中進行培養，每2天更換1次培養基。

1.4.2 動物造模及分組干預 HepG2細胞生長至培養瓶90%時進行傳代，傳代3次后，用PBS重懸至1×107／mL，取0.2 mL細胞懸液接種于裸鼠右腋皮下，接種48 h后可觸及腫瘤結節。接種后2d，依據簡單隨機抽樣法，將動物隨機分為模型組和治療組，每組5只。按照人與小鼠體表面積換算，治療組裸鼠所需扶正消瘤顆粒量為29 g／kg，用生理鹽水配置成所需濃度，0.2 mL／只灌胃，模型組裸鼠給予0.2 mL／只生理鹽水灌胃，均2次／d，連續21 d。

1.4.3 組織樣品的處理 接種后22 d，所有動物稱取重量后，按劑量2.5 m l／kg腹腔注射水合氯醛麻醉，而后開腹，下腔靜脈采血，置于2 ml EP管中，2 000 r／min離心15 min，留取血清用作生化檢測；剝離腫瘤組織，分析天平稱重后切取0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的一塊組織置于預先留有編號標簽的包埋框中，將裝有腫瘤組織的包埋框置于10%福爾馬林溶液中固定。其余腫瘤組織裝入2 ml EP管中置于-70℃超低溫冰箱中保存備用。根據腫瘤重量計算抑瘤率，抑瘤率＝［1-（治療組平均瘤重／模型組平均瘤重）］×100%。

1.4.4 生化指標檢測 動物血清中ALT、AST、Alb以及AFP等的檢測方法均參照試劑盒說明書。

1.4.5 免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟至水，將組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液（pH6.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，中火8 min至沸，停火8min保溫再轉中低火7 min，自然冷卻后將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，阻斷內源性過氧化物酶；在組化圈內滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按1∶500配好的一抗，切片平放于濕盒內4℃孵育過夜；玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；切片稍甩干后在圈內滴加二抗HRP覆蓋組織，室溫孵育50 min；玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液；蘇木素復染3 min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數秒，自來水沖洗，返藍；脫水封片，顯微鏡鏡檢，Pannoramic viewer軟件圖像采集。

1.4.6 蛋白質免疫印跡檢測 將兩組裸鼠腫瘤組織切成小塊，加入RIPA裂解液，4℃下12 000 r／min離心30 min取上清液，BCA法測定蛋白濃度。兩組樣品蛋白上樣量為20μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜；用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫下封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜；TBST洗3次，每次10 min；加二抗，室溫下孵育2 h，TBST洗膜后顯影，Quantity One軟件分析條帶灰度值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 25.0進行數據統計，計量資料用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 荷瘤裸鼠體重、瘤重、瘤體比以及抑瘤率情況 見表1、插頁圖1。所有裸鼠均造模成功。隨著移植瘤體積不斷增大，模型組裸鼠逐漸出現活動減少，進食水減少，消瘦，呈惡病質狀態；治療組裸鼠精神狀態明顯好于模型組，活動基本正常。

表1 荷瘤裸鼠體重、瘤重、瘤體比及抑瘤率比較 （±s）

表1 荷瘤裸鼠體重、瘤重、瘤體比及抑瘤率比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05

組別 例數 體重（g） 瘤重（g） 瘤體比（%）抑瘤率（%）5 19.28±0.57 0.94±0.06 4.89±0.46 0治療組 5 20.16±0.24* 0.65±0.10* 3.23±0.53*模型組30.85

2.2 荷瘤裸鼠肝功能檢測結果 見表2。

表2 荷瘤裸鼠血清生化檢測結果比較 （±s）

表2 荷瘤裸鼠血清生化檢測結果比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05

組別 例數 ALT（U／L） AST（U／L） Alb（g／L） AFP（U／L）模型組5 20.76±3.71 20.39±4.93 10.19±0.57 31.91±5.12治療組5 20.59±2.98 20.68±3.76 9.98±0.63 23.45±4.78*

2.3 荷瘤裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1及Bcl-xL表達情況 免疫組化結果顯示，治療組裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表達均低于模型組（P＜0.05）。見插頁圖2。蛋白質印跡結果顯示，與模型組比較，治療組裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表達顯著降低（P＜0.01）。見圖3。

3 討論

中醫學認為，正氣虧虛，瘀毒痰濕互結是肝癌發生的基本病機，正氣虛、毒邪盛是其復發、轉移的關鍵。扶正消瘤顆粒由黃芪、黨參、菝葜、鱉甲、牡蠣等組成，具有益氣解毒、活血化瘀、化痰祛濕的功效，且以扶正為主，兼以祛邪，攻補兼施，祛邪而不傷正，主要用于各期肝癌，臨床療效可靠［6］。

本研究顯示，扶正消瘤顆粒具有明顯的抗腫瘤活性（P＜0.05），可以抑制肝癌移植瘤的生長和增殖。FGFR4是一種酪氨酸激酶受體，可選擇性地結合成纖維細胞生長因子19（FGF19），通過下游MAPK和AKT信號通路介導細胞效應，誘發肝癌［7］。基質金屬蛋白酶家族（MMPs）屬于鋅依賴性內肽酶，在細胞侵襲和遷移過程中參與細胞外基質（ECM）的降解［8］，MMP-2是其一個重要成員，能降解多種細胞外基質，如明膠、層黏連蛋白以及I型膠原等，在腫瘤細胞透過細胞外基底膜遷移以及其他過程中發揮重要作用，在肝癌組織中異常高表達，與肝癌的侵襲和轉移密切相關［9］。細胞周期蛋白調控細胞周期的各個時相，其中參與細胞周期調控的主要因子是Cyclin。調控G1期的關鍵蛋白之一是Cyclin D1，在細胞周期中，G1期的啟動是細胞周期的關鍵，過度表達Cyclin D1蛋白可使細胞G1期縮短，導致腫瘤細胞過度增殖。研究表明，Cyclin D1基因表達下調能抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡［10］。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，其過表達可以抑制肝癌細胞凋亡［11］。本研究顯示，扶正消瘤顆粒可以下調瘤體組織中FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表達，具有抑制肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的潛力，進而抑制肝癌進展。

綜上所述，扶正消瘤顆粒具有抑制HepG2肝癌裸鼠移植瘤生長的作用，其抗腫瘤機制可能與下調FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表達有關，為探索治療肝癌的新方法提供了思路與依據。但中藥抗腫瘤作用具有多環節、多靶點的特點，扶正消瘤顆粒在體內的抗腫瘤作用可能還有其他作用機制，尚需進一步研究。