微山湖地區寬體金線蛭的群體考察與產繭后藥材質量評價△

李明玥，劉金欣，王銘昕，黃秋陽，石林春*，馬莉*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 國家中醫藥管理局資源保護重點研究室 中藥資源教育部工程中心，北京 100193；2. 友搏藥業微山水蛭養殖基地，山東 濟寧 277600；3. 首都醫科大學 中醫藥學院，北京 100069

寬體金線蛭WhitmaniapigraWhitman，俗稱螞蟥，其干燥全體可作為中藥材水蛭在臨床上使用[1]。水蛭是我國傳統的活血化瘀藥，始載于《神農本草經》，藥性峻猛，具有破血通經、逐瘀消癥的功效，主治血瘀經閉、癥瘕痞塊、中風偏癱、跌打損傷[1]。現代研究表明水蛭具有改善血液流變學、抗凝血、抑制血栓形成、抗腫瘤等藥理活性[2-14]。我國以水蛭為原料的中成藥有90余種，其中脈血康膠囊、疏血通注射液、通心絡片、腦血康滴丸等中成藥被納入2019年《國家基本醫療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄》。除脈血康膠囊等少數中成藥明確使用日本醫蛭HirudonipponicaWhitman外，多數中成藥實際以寬體金線蛭入藥。通常認為寬體金線蛭不含水蛭素類成分，其藥用有效成分的研究一直受到關注。Zhong等[15]利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離得到分子量為8608 Da的抗凝血多肽(whitmanin)。Liu等[16]從寬體金線蛭中分離得到長度為30個氨基酸的新型抗血栓多肽(WP-30)，可選擇性抑制由凝血酶誘導的血小板聚集作用。

據世界衛生組織全球疾病負擔報告分析，自1990年起全球因心血管疾病致死的人數顯著增長[17-19]，水蛭作為治療心血管疾病的常用中藥，其需求量逐年增加，2009—2016年進入快速增長期，價格由2009年約400元/kg上漲至1000元/kg以上[20]。捕撈野生寬體金線蛭的收入超過了一般農業生產，使越來越多的人去捕撈野生寬體金線蛭。無序、過度捕撈破壞了寬體金線蛭的可持續發展，加之工農業污染導致寬體金線蛭的生境被破壞，野生寬體金線蛭的資源儲量日益減少。自2008年起，由于中成藥研發和生產需求旺盛，水蛭藥材的用量以每年約30 t遞增[20-24]，而我國野生水蛭產量以每年15%～20%的速度遞減，日益枯竭的水蛭野生資源和不斷增長的生產需求形成了嚴重的供需矛盾，人工養殖將成為水蛭藥材來源的重要補充。然而，寬體金線蛭的人工繁育技術尚不成熟，多數養殖基地以野外采集的寬體金線蛭“青年苗”進行生產，現有研究主要集中于溫度等因素對寬體金線蛭幼苗生長速度的影響[25-29]、不同采收時間和炮制方法等因素對藥材采收質量的影響[30-34]、養殖基地農藥與重金屬污染對水蛭質量的影響[35]、高溫環境下生病螞蟥的病原分析[36]等下游環節，在寬體金線蛭種蛭篩選方面尚缺乏系統研究。此外，寬體金線蛭產繭后再入水死亡率較高，養殖價值低，生產中通常將產繭后的寬體金線蛭制成藥材銷售，其藥材質量尚缺乏系統評價標準。

微山湖是寬體金線蛭的主產區之一，歷史上其產量曾占全國總產量的60%以上。本研究以微山湖地區的寬體金線蛭野生種群為研究對象進行群體考察，嘗試建立寬體金線蛭種蛭篩選原則，并對產繭后藥材進行質量評價，為寬體金線蛭人工養殖種蛭篩選提供科學依據，同時也為春產水蛭藥材的合理應用提供參考。

1 材料

1.1 樣品

實驗用寬體金線蛭為2018年4月在山東省棗莊市微山湖地區漁民捕撈所得，共計1193條，經中國醫學科學院藥用植物研究所石林春副研究員鑒定為真蛭亞綱(Euhirudinea Lukin)無吻蛭目(Arhynchobdellida Blanchard)黃蛭科(Haemopidae Sawyer)金線蛭屬(WhitmaniaBlanchard)寬體金線蛭WhitmaniapigraWhitman。所有水蛭養在裝有防逃設施的塑料容器內，每隔2 d換1次水，養殖用水為經充分曝氣24 h以上的自來水。

1.2 儀器和試藥

移液槍(德國Eppendorf公司)；TD20002電子天平(天津天馬儀器廠)；精密電子天平PL203(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Sartorius PB-10pH計(德國賽多利斯公司)；LUX-24數顯恒溫水浴鍋(北京陸希科技有限公司)；3K15型離心機(德國Sigma公司)；超純水儀(美國Millipore公司)。

三羥甲基氨基甲烷(AMRESCO，批號：2201C465)；凝血酶(SigmaT4648,批號：SLBV3604),牛纖維蛋白原(SolarbioF8050，批號：523C021)；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 群體特征考察與試驗分組

使用電子天平對1193條寬體金線蛭依次稱量體質量，根據其生殖環帶顏色的深度和寬度判斷是否完成受精，從而考察微山湖地區寬體金線蛭的群體分布特點，根據群體特征考察結果將寬體金線蛭分為10 g(8～12 g)、15 g(13～17 g)、20 g(18～22 g)3個試驗組，每組不少于30只。

2.2 繁殖池

為了便于計數、防止不同試驗組間寬體金線蛭逃竄，繁殖池使用60目的尼龍網制成上端開口的長方形網兜(見圖1)，網兜中裝入適量土壤，在網兜外部堆積適量土壤以達到保溫保濕作用，產繭期間除適量澆水以保持適宜土壤濕度外，不作過多干擾，使其自然產繭。同時，為減少頻繁檢查對種蛭產繭的擾動，設置1個參照組以實時查看卵繭的成熟度，結合寬體金線蛭胚胎發育時相，選擇適宜的挖繭時機。

圖1 寬體金線蛭的繁殖池

2.3 繁殖性能考察指標

2.3.1產繭數 當參照組中60%的卵繭都處于發育中晚期時，挖出每個試驗組繁殖池中的卵繭，獨立計數，統計卵繭的總數目，以每個寬體金線蛭平均產得的卵繭數目作為該試驗組的產繭數。

2.3.2繭體積 從每個試驗組中隨機挑選50%的卵繭，使用游標卡尺測量卵繭的長和寬，并計算平均值。

2.3.3出苗數 從每個試驗組中隨機挑選20個處于發育晚期的卵繭，在卵繭的較尖一端小心開口，用蒸餾水將寬體金線蛭的幼苗從卵繭中沖刷至培養皿中，獨立計數，計算平均值。

2.4 產繭后水蛭藥材質量質量評價

依照《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)對上述3個試驗組產繭前后的水蛭藥材分別進行性狀觀察和抗凝血酶活性測定。

精密稱定寬體金線蛭待測樣品粉末(過三號篩)1 g，精密加入0.9%氯化鈉溶液5 mL，充分攪拌，浸提30 min，并時時振搖，5000 r·min-1(離心半徑7.6 cm) 離心15 min，精密量取上清液100 μL于2 mL離心管中，加入含0.5%牛纖維蛋白原的Tris-HCl緩沖液(現用現配)200 μL，混合均勻，置于37 ℃水浴溫浸5 min，滴加凝血酶(10 U·mL-1，每4 min滴加1次，每次2 μL，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，計算各樣品對應的抗凝血酶活性。

3 結果

3.1 微山湖地區寬體金線蛭野生種群特征考察

共采集寬體金線蛭1193條，其體質量的平均值為(11.17±5.51)g，中位數為9.68 g，第一和第三四分位數分別為7.26和13.58，體質量總體偏小。體質量<6 g的寬體金線蛭有151條，占比12.66%；體質量≥10 g的寬體金線蛭有567條，占比47.53%；體質量≥15 g的寬體金線蛭有233條，占比19.53%。寬體金線蛭的生殖環帶位于24～42環，完成受精后的生殖環帶呈現金黃色(見圖2A)，生殖環帶的顏色、深度和寬度隨寬體金線蛭體質量的增加而加深和變寬，體質量<6 g的寬體金線蛭多數生殖環帶不明顯，體質量≥10 g的寬體金線蛭均能觀察到較明顯的生殖環帶，體質量≥15 g寬體金線蛭的生殖環帶顏色顯著加深和變寬，觸之可迅速蜷縮成球，并呈現較強的彈性(見圖2 B～C)。

注：A.具有生殖環帶的寬體金線蛭；B.受到刺激蜷縮成球(腹部)；C.受到刺激蜷縮成球(背部)。圖2 寬體金線蛭的形態特征

寬體金線蛭生殖環帶的成熟度與體質量關系密切，本研究根據群體特征將其分成3個試驗組：10 g組(8～12)g、15 g組(13～17) g、20 g組(18～22)g，在群體中的數目分別為395、148、114條。

3.2 體質量對寬體金線蛭繁殖性能的影響

生殖環帶發育成熟的寬體金線蛭入土約1周后即可產繭，卵繭的發育周期約為3～4周，卵繭的成熟度使用自制的LED燈箱進行檢測，大致分為早、中、晚3個時期(見圖3A～C)，早期卵繭呈粉紅色，繭液在LED燈下清亮透明，中期卵繭呈棕黃色，在LED燈下可觀察團狀胚胎陰影，后期卵繭變空，肉眼可觀察到黑褐色寬體金線蛭幼體。3個時期分別對應發育時相的囊胚期、體節期和孵化期。囊胚期(見圖3 D)在卵裂作用下細胞數快速增加，前期體積無明顯變化，后期經原腸運動，卵黃細胞被完全包被在胚胎內部，形成卵黃合胞體層；在體節期(見圖3 E)完成體節分化、神經管形成、前后吸盤和其他器官原基開始出現；孵化期(見圖3 F)完成器官的最終發育，并孵化為可以自由游動的寬體金線蛭幼體[37-39]。

本研究在卵繭發育的晚期進行挖繭作業。3個試驗組的產繭數差異明顯，分別為3.7、4.5、5.9個，20 g組的產繭數是10 g組的1.59倍。繭體積雖然隨寬體金線蛭體質量的增加而變大，但差異并不明顯，繭的長度為19.11～21.10 mm，繭的寬度為14.19～16.30 mm(見圖4)。從出苗數來看，各試驗組內卵繭的個體間均存在一定的差異，在箱形圖上均呈現較寬的分布區間，20 g組單個繭平均出苗37.3條，是10 g組的1.45倍(見圖5)。

注：A.早期發育階段的卵繭；B.中期發育階段的卵繭；C.晚期發育階段的卵繭；D.囊胚期；E.體節期；F.孵化期。圖3 不同發育階段的卵繭和不同發育時相的寬體金線蛭

圖4 不同體質量組寬體金線蛭卵繭體積

圖5 不同體質量組寬體金線蛭卵繭出苗數

3.3 寬體金線蛭產繭后藥材的質量評價

3個試驗組的寬體金線蛭在產繭后體質量損失率接近，處于54%～59%，18～22 g試驗組的體質量平均值由20.59 g減少到8.71 g，各試驗組的存活率存在較顯著差異，20 g組的存活率是10 g組的1.44倍(見表1)。寬體金線蛭產繭后體質明顯變差，吊干后藥材的質量變輕，寬度變窄，厚度僅為產繭前藥材厚度的48.98%～71.79%，但藥材的長度變化并不明顯(見表2)。背部顏色變化不明顯，但腹部顏色由棕黃色變為黑棕色(見圖6)。藥材的腥味略有下降，斷面顏色變深，較產繭前難折斷，脆度下降。采用凝血酶滴定法測定各組藥材的抗凝血酶活性后發現，各組每l g藥材含抗凝血酶活性為3～5 U(見表3)，產繭前后抗凝血酶活性變化不大(結果詳見表3)，均符合《中國藥典》標準。

表1 不同體質量分組的寬體金線蛭產繭前后的變化

注：A.10 g組(產繭前)；B.15 g組(產繭前)；C.20 g組(產繭前)；D.10 g組(產繭后)；E.15 g組(產繭后)；F.20 g組(產繭后)。圖6 產繭前后藥材性狀比較

表2 產繭對寬體金線蛭藥材性狀的影響

表3 產繭對寬體金線蛭抗凝血酶活性的影響

4 討論

4.1 寬體金線蛭的種群特點與種蛭篩選原則

種蛭篩選是寬體金線蛭養殖的重要環節，本研究表明水蛭的產繭數、出苗數等主要繁殖性能指標隨寬體金線蛭體質量的增加而顯著提高，20 g組可獲得的幼蛭數目為同等種蛭數目10 g組可獲得的幼蛭數的231.43%，種蛭的死亡率也更低，相差約4.1倍。使用體質量大的水蛭進行繁殖將獲得更多的幼蛭，損失的水蛭也較少，史紅專等[28]推薦人工養殖時應選擇體質量在20 g左右的寬體金線蛭作為種蛭。但是，體質量≥20 g的寬體金線蛭僅占野生種群的9.05%，若以整個種群進行計算，10、15、20 g組可分別獲得3.8、2.1、2.5萬條幼蛭。因此，僅使用≥20 g的寬體金線蛭進行繁殖并不現實、也不經濟，可以使用≥20 g的寬體金線蛭構建良種選育群體[40]，建議以15 g及以上的寬體金線蛭進行繁殖生產。此外，本研究還發現微山湖地區野生寬體金線蛭的體質量普遍較小，有超過30%的寬體金線蛭體質量<8 g，這表明微山湖地區野生寬體金線蛭的種群有退化趨勢，成年水蛭、特別是體質量較大的多年生寬體金線蛭數量較少，這與微山湖地區過度捕撈及生態環境惡化有關，有研究指出微山湖地區的重金屬污染已達到重度污染水平[41]，有機氯農藥污染水平也高于國內其他地區湖泊[42]，相關部門應在微山湖地區“退漁還湖”背景下加強對寬體金線蛭捕撈的科學指導，春秋“捕大放小”、夏季禁止捕撈。對微山湖地區寬體金線蛭進行群體考察，不僅能為制定合理的寬體金線蛭種蛭篩選原則提供科學依據，從而提高人工養殖的效率，同時也能反映微山湖地區寬體金線蛭的種群特點，為相關部門加強對寬體金線蛭捕撈的科學指導提供參考意見。

4.2 產繭對水蛭藥材質量的影響

由于越冬技術不成熟，生產中常以野外捕撈的寬體金線蛭進行繁殖育苗，通常不進行分揀直接入土繁殖，產繭后多數寬體金線蛭觸之不能很快成球，直接死亡率約30%，入水后死亡率可達70%以上，因此多數養殖戶將產繭后的水蛭直接加工成藥材進行銷售。此時，藥材的厚度明顯變薄，僅為產繭前藥材厚度的50%或更低，脆度降低，這可能與寬體金線蛭產繭過程中消耗能量過多導致體質變差，吊干時寬體金線蛭肌肉彈性降低有關。產繭前后藥材的抗凝血酶活性變化不大，均為3～5 U·g-1，但低于歐興長等[43]測定的寬體金線蛭藥材抗凝血酶活性，與單宇等[3]以及丁月珠等[44]的研究接近。吳曼郡等[45]的研究表明寬體金線蛭的抗凝血酶活性與其吸食密切相關，吸食后第5天達到最高值14.67 U·g-1，第11天降低到6.50 U·g-1。寬體金線蛭的冬眠時間約為3～4個月，冬眠期間頭部和尾部彎曲呈“彎月”狀，不食不動，呼吸代謝和消化代謝非常微弱[46-47]，春季為寬體金線蛭抗凝血酶活性的低谷期。同時，《名醫別錄》[48]記載，水蛭“五月、六月采”，相當于公歷的6、7月份，《中國藥典》也規定水蛭的采收時間為夏、秋兩季。此外，春季是寬體金線蛭的繁殖期，大肆捕撈野生寬體金線蛭會對其生存造成毀滅性破壞，不利于寬體金線蛭野生資源的可持續發展。因此，不建議春季進行野生水蛭藥材采收，產繭后所獲得的藥材也不建議作為臨床飲片使用。