基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析技術(shù)的胡桃楸根HPLC指紋圖譜分析△

劉宏，陳晨，邸學(xué)，張慧，康廷國，王添敏

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim.又名核桃楸、山核桃，為胡桃科胡桃屬植物。主產(chǎn)于我國黑龍江、遼寧、吉林、河北、山西等地[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，胡桃楸的不同部位均具有抗腫瘤作用[2-6]。我國和韓國也一直應(yīng)用胡桃楸根、莖枝、樹葉和果皮等不同部位治療胃癌、食管癌和肝癌等多種惡性腫瘤[7-8]。目前胡桃楸未在《中華人民共和國藥典》中收載，僅在《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中記載了胡桃楸皮具有抗腫瘤作用[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，胡桃楸根也具有較好的抗腫瘤作用[10-13]，其中主要含有萘醌、鞣質(zhì)、二芳基庚烷、黃酮等化合物[6，8，14-15]，但關(guān)于胡桃楸根的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究較少。因此，本研究收集了23批不同產(chǎn)地的胡桃楸根藥材，進(jìn)行指紋圖譜及相似度研究，并通過主成分分析明確不同產(chǎn)地胡桃楸根指紋圖譜的差異性成分；利用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)胡桃楸根中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。通過胡桃楸根指紋圖譜的建立及化學(xué)成分研究，為胡桃楸根的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1260型安捷倫高效液相色譜儀、6550型安捷倫高分辨質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；TDZ4-WS型低速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；Sartorius電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈(色譜純，德國merck公司)；甲醇、甲酸(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；純凈水(大連娃哈哈飲用水有限公司)；對(duì)照品沒食子酸(批號(hào)：410860050)、逆沒食子酸(批號(hào)：117710025)均購自上海Sigma-Aldrich公司，純度≥98%；1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖和1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖由實(shí)驗(yàn)室分離純化，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測(cè)定其純度≥96%。

23批胡桃楸根藥材均產(chǎn)地收集，見表1。所有藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為胡桃科植物胡桃楸Juglansmandshurica的根。

表1 采集的胡桃楸根藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1色譜條件 色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，預(yù)柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18(5 mm×2.1 mm，2.7 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相A為0.2%甲酸水，流動(dòng)相B為0.2%甲酸乙腈，梯度洗脫(0～5 min，95%～90%A；5～25 min，90%～84%A；25～40 min，84%～78%A；40～45 min，78%～55%A；45～50 min，55%～35%A；50～52 min，35%～0%A；52～55 min，0%～0%A)，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL，檢測(cè)波長270 nm，后運(yùn)行時(shí)間為10 min。

2.1.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，在負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，MS掃描范圍m/z100～1700，MS/MS掃描范圍m/z100～1700；離子源電壓3500 V；干燥和保護(hù)氣體溫度350 ℃；碰撞電壓75 V；碰撞能量30 eV；流速8 L·min-1；霧化器壓力241 325 Pa。

2.2 溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 分別取對(duì)照品逆沒食子酸、沒食子酸、1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖適量，精密稱定，置于量瓶中，加入50%甲醇溶液(含0.5%甲酸)溶解，稀釋至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.3、0.3、1、1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2供試品溶液制備 取不同產(chǎn)地胡桃楸根粗粉約0.2 g，精密稱定，置具塞離心管中，分別精密加入50%甲醇(含0.5%甲酸)10 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率200 W，頻率50 kHz)處理30 min，放冷，用50%甲醇(含0.5%甲酸)補(bǔ)足減失質(zhì)量，2200×g離心5 min，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn) 精密稱取胡桃楸根藥材0.2 g(批次S10)，按照2.2.2供試品溶液制備方法制備，在2.1.1項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，選取1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖作為參照峰，測(cè)得各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.84%以下；相對(duì)峰面積的RSD為1.89%～3.87%，表明該儀器精密度良好。

2.3.2重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取胡桃楸根藥材0.2 g(批次S10)，平行6份，按照2.2.2供試品溶液制備方法制備，在2.1.1項(xiàng)條件下平行進(jìn)樣分析，選取1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖作為參照峰，測(cè)得各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.9%以下；相對(duì)峰面積的RSD為1.74%～4.63%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取胡桃楸根藥材0.2 g(批次S10)，按照2.2.2供試品溶液制備方法制備，在2.1.1項(xiàng)條件下，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，選取1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖作為參照峰，測(cè)得各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.91%以下；相對(duì)峰面積的RSD為1.51%～4.47%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

按照2.2.2供試品溶液制備方法制備23批胡桃楸根樣品，在2.1.1項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將所得的23批胡桃楸根HPLC圖以AIA格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A)”軟件建立指紋圖譜共有模式見圖1，經(jīng)多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配生成對(duì)照指紋圖譜見圖2，其中共有峰18個(gè)。以“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A)”軟件生成的胡桃楸根對(duì)照指紋圖譜為參照，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。

圖1 23批胡桃楸根HPLC指紋圖譜共有模式

注：2. 沒食子酸；4. 1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖；6. 1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖；10. 逆沒食子酸；11. 1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖。圖2 胡桃楸根的對(duì)照指紋圖譜

表2 23批胡桃楸根藥材相似度分析結(jié)果

如表2所示，23批胡桃楸根樣品相似度為0.731～0.986，除樣品S4(0.731)、S8(0.883)、S12(0.855)相似度較低外，其余樣品相似度均大于0.90。將S4、S8、S12的色譜圖與對(duì)照指紋圖譜(R)進(jìn)行對(duì)比以分析3批樣品相似度低的原因。如圖3所示，樣品S4中各成分的含量較對(duì)照指紋圖譜中高，其中共有峰F4、F6、F11的含量顯著高；樣品S8中各成分的含量較對(duì)照指紋圖譜中低，其中共有峰F7、F11、F13、F14的含量顯著低；樣品S12中共有峰F6的含量較低，共有峰F9和F13的含量較高。由上述分析可知，S4、S8、S12樣品中各成分含量的比例與對(duì)照指紋圖譜不同，使得3批樣品相似度較低。3批樣品的產(chǎn)地、采收時(shí)間和加工方法并無特殊之處，由于藥材質(zhì)量受多因素影響，造成3批樣品中成分含量與其他樣品不同的原因仍有待進(jìn)一步研究。

圖3 樣品S4、S8、S12的色譜圖與對(duì)照指紋圖譜(R)對(duì)比

2.5 主成分分析

由2.4指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果可知，23批胡桃楸根樣品的相似度結(jié)果波動(dòng)較大，23批胡桃楸根指紋圖譜存在一定差異，為了明確造成胡桃楸根指紋圖譜差異的主要成分，對(duì)23批胡桃楸根樣品指紋圖譜進(jìn)行了主成分分析。以胡桃楸根對(duì)照指紋圖譜中的24個(gè)主要色譜峰的峰面積為變量，得到23×24階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析，其特征值和累積方差貢獻(xiàn)率結(jié)果見表3。

表3 23批胡桃楸根樣品的相關(guān)矩陣

由表3可知，以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)，提取了胡桃楸根樣品中前5個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為82.044%，可以代表23批胡桃楸根樣品24個(gè)變量82.044%的信息，因此利用前5個(gè)主成分可進(jìn)行主成分分析。

從成分載荷矩陣表4可以看出，第一主成分的獨(dú)立貢獻(xiàn)率為36.716%，主要反映原始變量F1、F2、F3、F4、F6、F11、F20的信息；第二主成分的獨(dú)立貢獻(xiàn)率為18.843%，主要反映原始變量F9、F17、F19的信息；第三主成分的獨(dú)立貢獻(xiàn)率為14.778%，主要反映原始變量F21、F23的信息。說明上述成分對(duì)不同批次胡桃楸根指紋圖譜的差異貢獻(xiàn)較大，可能是造成胡桃楸根質(zhì)量差異的關(guān)鍵成分。

表4 23批胡桃楸根樣品的成分載荷矩陣

2.6 化學(xué)成分研究

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS負(fù)離子模式分析胡桃楸根中的化學(xué)成分，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入質(zhì)譜分析軟件(MassHunter Qualitative Analysis Version B.0400)分析處理，根據(jù)所測(cè)化合物的精確分子量以及二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子，通過與對(duì)照品以及文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，從胡桃楸根中鑒定出88個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見表5，質(zhì)譜總離子流圖見圖4。鑒定的88個(gè)成分中包括16個(gè)共有成分和11個(gè)對(duì)胡桃楸根指紋圖譜差異貢獻(xiàn)較大的成分。

表5 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析鑒定的胡桃楸根中的化學(xué)成分

續(xù)表5

續(xù)表5

續(xù)表5

圖4 胡桃楸根樣品(S11)的總離子流圖

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同提取溶劑(30%、50%、70%、90%甲醇溶液)以及溶劑中是否加酸進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，50%甲醇和70%甲醇溶液提取的峰面積較大，兩者接近，但70%甲醇溶液提取的峰形不對(duì)稱，故選取50%甲醇溶液作為提取溶劑；由于胡桃楸根中主要含有鞣質(zhì)、有機(jī)酸類化合物，提取溶劑中加酸對(duì)樣品中化學(xué)成分的提取效果明顯增高，因此選擇在提取溶劑中加入0.5%的甲酸。

3.2 色譜條件的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相中不同有機(jī)相(乙腈、甲醇、0.2%甲酸乙腈、0.2%甲酸甲醇)、不同水相(水、0.2%甲酸水)對(duì)指紋圖譜的影響，最終選擇0.2%甲酸乙腈為有機(jī)相，0.2%甲酸水為水相進(jìn)行梯度洗脫，此色譜條件下分離效果較好，色譜峰峰數(shù)較多，峰形較好。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)25、30、35 ℃等3種不同的柱溫進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，30 ℃時(shí)峰形最佳且分離度良好，故本研究柱溫選擇30 ℃。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)檢測(cè)器進(jìn)行全波長掃描，比較各波長下指紋圖譜峰的高度、峰數(shù)及基線，最終選擇270 nm為檢測(cè)波長。

3.3 相似度和主成分分析

關(guān)于胡桃楸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量評(píng)價(jià)研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC建立了胡桃楸根藥材的指紋圖譜。由相似度可知，除樣品S4、S8、S12相似度較低外，其余樣品相似度均大于0.90，說明在遼寧和吉林不同產(chǎn)地收集的胡桃楸根樣品質(zhì)量較穩(wěn)定，產(chǎn)地對(duì)胡桃楸根質(zhì)量的影響不大。與對(duì)照指紋圖譜比較發(fā)現(xiàn)，樣品S4、S8、S12中的成分含量與對(duì)照指紋圖譜中成分含量存在明顯差異。3批樣品的產(chǎn)地、采收時(shí)間和加工方法并無特殊之處，由于藥材質(zhì)量還受生境等諸多因素影響，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)伴生植物、土壤等生境進(jìn)行詳細(xì)分析，因此造成3批樣品中成分含量與其他樣品不同的原因仍有待進(jìn)一步研究。

在相似度基礎(chǔ)上，對(duì)胡桃楸根樣品進(jìn)行了主成分分析，以期明確影響不同批次胡桃楸指紋圖譜差異的成分，由結(jié)果可知，胡桃楸根樣品中F1、F2、F3、F4、F6、F9、F11、F17、F19、F20、F21、F23是對(duì)胡桃楸根指紋圖譜差異貢獻(xiàn)較大的成分，這些成分可能是影響胡桃楸根質(zhì)量的關(guān)鍵成分。

3.4 化學(xué)成分分析

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS方法對(duì)胡桃楸根中化學(xué)成分進(jìn)行了鑒別，共鑒定出88個(gè)化合物。鞣質(zhì)類化合物共52個(gè)，為沒食子酰基、丁香酰基和香草酰基葡萄糖等；萘衍生物共14個(gè)，主要為四氫萘酮類化合物；蒽衍生物共8個(gè)；黃酮類化合物共6個(gè)；有機(jī)酸類化合物共5個(gè)；二芳基庚烷類化合物共2個(gè)；木脂素類化合物1個(gè)。

鑒定出的共有峰分別是檸檬酸(F1)、沒食子酸(F2)、單-O-HHDP-二-O-沒食子酰基-葡萄糖(F3)、1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(F4)、單-O-丁香酰基-葡萄糖(F5)、1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(F6)、三-O-沒食子酰基-葡萄糖(F7)、四-O-沒食子酰基-葡萄糖(F8)、單-O-HHDP-單-O-沒食子酰基-葡萄糖(F9)、逆沒食子酸(F10)、1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(F11)、三羥基-萘烷-沒食子酰基-葡萄糖苷(F12)、三羥基-萘烷-沒食子酰基-葡萄糖苷(F13)、五-O-沒食子酰基-葡萄糖(F14)、Juglanthracenoside A(F15)、五羥基-氧雜苯并[α]蒽酮-丁香酰基-己糖苷(F16)，其中F2、F4、F6、F10、F11是通過與對(duì)照品對(duì)照鑒定，共有峰F17、F18因缺少對(duì)照品未能鑒定其結(jié)構(gòu)。

鑒定出的對(duì)胡桃楸根指紋圖譜差異貢獻(xiàn)較大的成分分別為檸檬酸(F1)、沒食子酸(F2)、單-O-HHDP-二-O-沒食子酰基-葡萄糖(F3)、1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(F4)、1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(F6)、單-O-HHDP-單-O-沒食子酰基-葡萄糖(F9)、1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(F11)、二-O-HHDP-葡萄糖(F19)、單-O-丁香酰基-葡萄糖(F20)、二羥基-tetralone(F21)、羥基-二甲氧基苯酚-單-O-丁香酰基-葡萄糖(F23)，其中F17因缺少對(duì)照品未能鑒定其結(jié)構(gòu)。

4 小結(jié)

由于胡桃楸根具有較好的抗腫瘤作用，但對(duì)于胡桃楸根的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究仍不完善，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC建立了胡桃楸根藥材的指紋圖譜，并利用UPLC-Q-TOF-MS/MS方法鑒定了胡桃楸根中88個(gè)成分，可以較全面地反映胡桃楸根的化學(xué)成分信息。為明確造成胡桃楸根指紋圖譜相似度不同的差異成分，在相似度評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，對(duì)藥材進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明胡桃楸根樣品中12個(gè)化學(xué)成分是區(qū)分不同批次胡桃楸根指紋圖譜的主要成分，也可能是影響胡桃楸根質(zhì)量的關(guān)鍵成分。本實(shí)驗(yàn)通過胡桃楸根指紋圖譜的構(gòu)建及化學(xué)成分研究，以期為胡桃楸根的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供依據(jù)。