響應(yīng)曲面法優(yōu)化壁虎水溶性蛋白的提取工藝

張荳，宋肖樺，胡慧華

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

壁虎又名守宮、天龍、蝎虎等，為壁虎科動物無蹼壁虎GekkoswinhonisGüenther、多疣壁虎G.japonicusDumeril et Bibron或蹼趾壁虎G.subpalmatusGüenther等的全體，寒，咸，有小毒，具有祛風(fēng)定驚、解毒散結(jié)的功效[1]，主治中風(fēng)癱瘓、手足不舉、歷節(jié)風(fēng)痛、風(fēng)痙驚癇、小兒疳痢、疬風(fēng)瘰疬、血積成痞，療蝎螯等。目前國內(nèi)外眾多學(xué)者致力于研究壁虎抗腫瘤活性物質(zhì)、藥理作用，已有研究表明，壁虎多肽及蛋白質(zhì)組分可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2-4]。因此優(yōu)化壁虎蛋白質(zhì)的提取工藝對于進(jìn)一步的藥理作用研究具有重要意義。壁虎藥材尚未載入2015年版《中華人民共和國藥典藥典》，各地方標(biāo)準(zhǔn)對其質(zhì)量要求也無明確規(guī)定。因此，對蛋白質(zhì)含量的定量控制也是確保壁虎藥材療效的一個有效手段[5]。

正交試驗法優(yōu)化雖然能通過研究多種因素，減少實驗次數(shù)，最終找出最佳因素水平組合，但卻不能從整個區(qū)域中計算出單因素和指標(biāo)間確定的函數(shù)表達(dá)式即回歸方程，并且不能探討單因素之間的交互作用[6]，因此，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)見性、重復(fù)性差。Box-Behnken響應(yīng)曲面法因其可以準(zhǔn)確表達(dá)單因素與指標(biāo)之間的關(guān)系，已被廣泛用于各行業(yè)工藝的優(yōu)化[7]。本實驗擬通過單因素試驗與響應(yīng)面分析法設(shè)計篩選壁虎蛋白質(zhì)的提取工藝，以期為中藥壁虎水溶性蛋白質(zhì)的提取工藝研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂以及抑制腫瘤研究方面提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-P7型紫外分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；101-2AB型烘箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SB25-12DTD型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HC-3518型離心機(jī)(安徽省中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；HC-300T固體粉碎機(jī)(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)；FA1104B型萬分之一電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

牛血清白蛋白(BSA，北京索萊寶科技有限公司，批號：920T053)；所用試劑均為分析純；水為去離子水。

生品壁虎產(chǎn)自安徽，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)胡慧華副教授鑒定為壁虎科動物無蹼壁虎GekkoswinhonisGuenther的干燥全體。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備

2.1.1對照品溶液的配制 精密稱取 BSA標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用去離子水溶解并定容至100 mL，即得0.1 g·L-1的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.1.2考馬斯亮藍(lán)染液的配制 精密稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50 mL 90%的乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，后用去離子水定容至1000 mL，置燒杯中，超聲4 h，定量濾紙過濾[8]，即可置4 ℃冰箱中備用。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.3、0.6、0.8、1 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，補(bǔ)加去離子水至 1 mL，制成不同濃度的BSA溶液。然后分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染色溶液，染色5 min，搖勻。以第1份不含對照品溶液作為空白對照，595 nm為檢測波長，檢測對照品溶液的吸光度，以蛋白質(zhì)含量(X)為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。線性回歸方程為Y=9.853 7X+0.097 4，r=0.999 9，結(jié)果表明，0～100 μg線性關(guān)系良好。

2.1.4樣品的配制

2.1.4.1藥材預(yù)處理 將藥材粉末(過四號篩)置于干燥器內(nèi)干燥12 h后，包于濾紙包內(nèi)，用石油醚索氏提取10 h[9]。待藥渣揮干石油醚后收集，以備提取可溶性蛋白。

2.1.4.2供試品溶液的配制 精密稱取預(yù)處理后的藥材粉末0.72 g(相當(dāng)于索氏提取脫脂前1 g)，在考察提取因素條件下(超聲時間、超聲溫度、pH、料液比)超聲提取，5000 r·min-1離心(離心半徑8.8 cm)15 min，取上清液作為待測溶液，每個處理重復(fù)3次。分別吸取一定量的待測溶液，測定吸光度，按2.1.3項下BSA回歸方程計算中藥壁虎中水溶性蛋白的含量。

2.2 單因素試驗

2.2.1超聲提取時間對壁虎水溶性蛋白含量的影響

精密稱取預(yù)處理后的藥渣粉末0.72 g(相當(dāng)于脫脂前的藥材粉末質(zhì)量1 g)于100 mL錐形瓶中，以去離子水(pH為6.8)20 mL為提取溶劑，固定超聲提取溫度為50 ℃，料液比為1∶20，分別考察超聲時間10、20、40、60、80、100 min時壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，見圖1。

圖1 不同提取時間對蛋白質(zhì)含量的影響

從圖1可以看出，壁虎可溶性蛋白的含量隨提取時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，當(dāng)超聲時間為10～80 min時含量呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)超聲時間為80～100 min時含量呈現(xiàn)下降趨勢。綜上所述，可以確定提取時間為80 min時提取率最高。因此本研究在響應(yīng)曲面提取時間因素的3個水平選擇提取率較高的60、80、100 min。

2.2.2不同料液比對壁虎水溶性蛋白含量的影響 精密稱取壁虎預(yù)處理后的藥渣粉末0.72 g(相當(dāng)于脫脂前的藥材粉末質(zhì)量1 g)，以去離子水(pH為6.8)為提取溶劑，固定超聲提取溫度為50 ℃，超聲時間為20 min，分別考察料液比1∶5、1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶100時壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，見圖2。

圖2 不同料液比對蛋白質(zhì)含量的影響

從圖2可以看出，隨著料液比的增加，壁虎藥材可溶性蛋白的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)料液比在1∶5～1∶50時蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)料液比在1∶50～1∶100時蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢。綜上所述，可以確定料液比為1∶50時提取率最高。因此本研究在響應(yīng)曲面料液比因素的3水平選擇提取率較高的1∶30、1∶50、1∶70。

2.2.3不同pH對壁虎水溶性蛋白含量的影響 精密稱定壁虎預(yù)處理后的藥渣粉末0.72 g(相當(dāng)于脫脂前的藥材粉末質(zhì)量1 g)，固定超聲提取溫度為50 ℃，超聲時間為20 min，料液比為1∶20，分別考察加入去離子水(調(diào)pH分別為3、5、7、9、11、13)20 mL時壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，見圖3。

圖3 不同pH對蛋白質(zhì)含量的影響

從圖3可以看出，堿性條件下，壁虎藥材可溶性蛋白提取率顯著高于酸性和中性條件下，并且隨著pH的升高，提取的蛋白質(zhì)含量顯著增加，這可能因為壁虎含有較多的堿性氨基酸，隨著pH的升高，大量氨基酸在等電點附近沉淀析出。綜上所述，可以確定pH 14時蛋白質(zhì)含量最高，因此本研究在響應(yīng)曲面pH因素的三因素選擇12、13、14。

2.2.4不同溫度對壁虎水溶性蛋白含量的影響 精密稱定壁虎預(yù)處理后的藥渣粉末0.72 g(相當(dāng)于脫脂前的藥材粉末1 g)。以去離子水(pH為6.8)20 mL為提取溶劑，固定提取時間為20 min，料液比為1∶20，分別考察20、30、40、50、60、70、80 ℃時壁虎中水溶性蛋白的提取率(n=3)，見圖4。

圖4 不同溫度對蛋白質(zhì)含量的影響

從圖4可以看出，隨著溫度的增加，壁虎可溶性蛋白提取率呈現(xiàn)先上升又下降又上升的趨勢，但整體變化趨勢不明顯，同時考慮到超聲提取時，溫度不易控制，因此不將溫度納入壁虎蛋白提取工藝的考察范圍之內(nèi)。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計

2.3.1響應(yīng)模型建立與分析 在單因素考察的基礎(chǔ)上，確定提取時間、料液比、pH 3個因素，運用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型設(shè)計試驗組，將壁虎水溶性蛋白含量作為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。因素水平表見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 壁虎中水溶性蛋白提取工藝響應(yīng)面試驗因素水平

表2 壁虎中水溶性蛋白提取工藝響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 壁虎中水溶性蛋白提取工藝響應(yīng)面方差分析

對所記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出料液比(A)、pH(B)和提取時間(C)3個因素對壁虎水溶性蛋白含量影響的二次多項回歸方程：Y=189.27+54.78A+60.29B+4.59C+27.84AB+4.37AC-6.32BC-1.41A2-60.08 B2-10.24C2。從表3方差分析可知，該模型差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，決定系數(shù)R2=0.980 5，表明所得值與預(yù)測值擬合程度良好。失擬項P為0.053 5(>0.05)，說明失擬項差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明未知因素干擾小。

結(jié)果表明該回歸方程模型擬合度良好，實驗誤差小，能夠精準(zhǔn)反映A、B、C 3個因素對壁虎水溶出蛋白質(zhì)含量的影響，因此壁虎水溶性蛋白提取工藝的優(yōu)化可以采用此模型。回歸方程的顯著性表明：一次項回歸方程中，A、B差異有統(tǒng)計學(xué)意義，對蛋白質(zhì)含量的影響較大，而C差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在交互項中，AB交互項差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而其他2個交互項差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在二次項中，B2差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其他2項差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上所述，3個因素水平對蛋白質(zhì)含量的影響依次為：B>A>C。

2.3.2響應(yīng)曲面圖直觀分析 圖5～7為3個因素之間的三維曲面圖和二維平面等高線圖，從圖中可直觀得出因素之間的交互作用以及交互對蛋白質(zhì)含量的影響。

圖5 料液比和pH對蛋白質(zhì)提取影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

圖6 料液比和提取時間對蛋白質(zhì)提取影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

圖7 pH和提取時間對蛋白質(zhì)提取影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

圖5、7中響應(yīng)面圖pH坡度較陡，均表明pH對壁虎蛋白質(zhì)提取的影響較大，圖6中，料液比和提取時間的響應(yīng)面坡度較平緩，表明兩者對壁虎蛋白質(zhì)提取的影響不大。同時表明以上響應(yīng)面圖分析結(jié)果與方差分析結(jié)果相符。

2.3.3驗證實驗 根據(jù)單因素實驗和二次回歸模型總和分析，在Design-Expert 8.0.6軟件中，選擇目標(biāo)為水溶性蛋白含量最大值，預(yù)測得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)：料液比為1∶70，提取時間為84.33 min，pH為13.72。在此條件下，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測值為275.431 mg·g-1。為了驗證實驗結(jié)果的可靠性，要對模型的提取工藝進(jìn)行驗證。結(jié)合實驗的可操作性，將蛋白質(zhì)的提取工藝參數(shù)調(diào)整為：料液比為1∶70，提取時間為84 min，pH為14。

應(yīng)用此工藝條件進(jìn)行3次平行驗證實驗。結(jié)果壁虎藥材中總水溶性蛋白平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為272.92 mg·g-1，與預(yù)測值275.431 mg·g-1相比，RSD為0.54%，表明該響應(yīng)曲面方法得到的回歸模型與實際情況擬合很好，該模型可以很好預(yù)測壁虎蛋白質(zhì)提取含量。

3 討論

我國是原發(fā)性肝癌發(fā)病率和病死率均較高的國家，壁虎多肽活性組分能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長和增殖[10-12]，壁虎在民間更是被稱為“抗腫瘤之星”。但壁虎經(jīng)常被當(dāng)做蛤蚧的混淆品入藥。隨著壁虎被現(xiàn)代藥理研究和臨床應(yīng)用，其優(yōu)點被更多人所發(fā)現(xiàn)，今已廣泛治療臨床多種疾病[5]。壁虎藥材的傳統(tǒng)炮制方法是用竹片貫穿頭腹，將尾用繩固定于竹片上撐開，然后用微火烤干或陰干。在炮制過程中可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)和酶等活性物質(zhì)的破壞。現(xiàn)有研究表明，壁虎多肽及蛋白質(zhì)組分是其抗腫瘤作用的重要活性成分。因此，蛋白質(zhì)含量的定量測定可作為壁虎藥材質(zhì)量評價的一個重要指標(biāo)。

響應(yīng)曲面法具有精度高，預(yù)測性好的優(yōu)點[13]，能夠快速得出工藝中多因素影響的最佳條件。本試驗首先進(jìn)行了單因素試驗，然后采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法試驗進(jìn)行壁虎水溶性蛋白的超聲提取工藝優(yōu)化，建立的二次多項回歸模型顯著性良好，能夠準(zhǔn)確地反映3個因素對壁虎水溶性蛋白含量的影響。壁虎水溶性蛋白超聲提取最佳條件：料液比為1∶70，提取時間為84 min，pH為14，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為275.431 mg·g-1，通過驗證實驗可知，所采用的響應(yīng)面法優(yōu)化理論與試驗值相近，結(jié)果可靠。