藥用植物種質資源的超低溫保存△

李翠，陳東亮，陳曉英，雷明，郭曉云，繆劍華

廣西壯族自治區藥用植物園/廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530023

長久以來中藥用傳統方式為世人健康服務，其需求量正隨著人們對健康生活需求的提升而不斷增長。全世界75%以上的人口以植物作為治療、預防疾病的藥物來源。全國中藥資源普查資料顯示，我國目前處于瀕危狀態的植物有近3000種，其中藥用植物占60%～70%，特別是珍稀瀕危野生藥用植物資源量急劇下降，如紅景天、金線蓮和冬蟲夏草等，更是面臨著滅絕的危險。因此，藥用植物資源的保護同其他重要資源的保護一樣，具有非常重要的戰略意義。

藥用植物保存方式主要有原位保存和離位保存。離位保存主要為種子保存和離體保存。超低溫保存是20世紀60年代新興的一門技術，其為種質資源離體保存開辟了一條新路徑。藥用植物超低溫保存是指將藥用植物的莖尖、種子或花粉等組織或器官在超低溫冰箱(-80 ℃)、液氮蒸汽相(-150～-180 ℃)或液氮(-196 ℃)中冷凍保存并成功復蘇的方式[1]，目前最主要的冷源為液氮。

1 藥用植物超低溫保存原理及優勢

超低溫保存原理主要有細胞凍害理論和溶液玻璃化理論2種。從本質上講，藥用植物超低溫保存主要是藥用植物細胞、組織、器官等在超低溫冷凍過程中，細胞的生長和酶的代謝活動接近停止，處于 “假死 ” 狀態，當其恢復到合適條件時又能進行正常的生長發育。在這一系列過程中，藥用植物細胞僅發生了可逆的物理結構變化，化學組成并沒有發生實質性改變，避免了材料在保存過程中可能造成的細胞活性損傷及遺傳性狀的退化和變異，因此其在解凍后仍然能保持正常細胞的生長、代謝活性、形態發生潛能及遺傳穩定性[2]。

相對活體保存、種子保存等其他種質資源保存方法，藥用植物超低溫保存不受季節、土壤、氣候等自然環境條件影響，能使保存的材料免受病、蟲、毒的侵害，便于國際和地區間的種質交換，隨時快速繁殖大量健康植株，保存過程可以減少大量人力、物力和財力，更重要的是使種質資源得以長期保存且不需考慮基因丟失、遺傳變異等問題。超低溫保存已成為目前公認的最為安全、經濟、有效的藥用植物種質資源保存方法，尤其是針對中間性種子藥用植物、頑拗性種子藥用植物及無性繁殖藥用植物材料。

2 藥用植物超低溫保存技術

2.1 材料的選擇

材料大小、抗凍性及細胞的生理狀態和年齡等因素對超低溫保存效果有較大的影響，其中植物細胞的生長年齡是決定復蘇率的最重要因素[3]，因此，應根據植物種類，選擇適宜進行超低溫保存的材料類型并適時取材。藥用植物超低溫保存材料主要有幼嫩組織、組織培養物和植物器官三大類。從目前的研究來看，大多數植物材料在成熟期的冷凍保存效果較好。種子在形態后熟和生理后熟過程中自由水含量大大降低，是目前超低溫保存應用最多的藥用植物材料，而體積小、細胞質稠密、無液泡、薄壁的小分生細胞的存活率高于含大量液泡的大細胞。

藥用植物的一些幼嫩組織(如莖尖分生組織和芽)因細胞分化程度低、在保存后的再生過程中遺傳穩定性好，是超低溫保存的理想材料[2]。目前，已成功實現高山紅景天、百合等藥用植物莖尖的超低溫保存，液氮冷凍保存后莪術莖尖的成活率達到90%以上[4]。愈傷組織本身極易發生染色體的自發畸變而變異且胚狀體一般是由愈傷組織分化而來，因此，藥用植物愈傷組織和胚狀體是最常見的超低溫保存組織培養物。目前，已成功實現人參等植物的愈傷組織和浙貝母等植物的胚狀體的超低溫保存，且保存后成活率均在60%以上[25]。花粉和種子是藥用植物超低溫保存的2類器官材料。由于花粉和一些種子的生長壽命時間較短而遺傳多樣性又極其豐富，所以花粉和種子的保存對完善藥用植物種質資源具有重要的意義。

2.2 材料的預處理

超低溫保存成功的關鍵在于藥用植物組織含水量的多少。低溫冰凍及化凍過程會使保存材料細胞內水結冰、降低細胞的含水量，對材料進行適當脫水是植物組織保存的關鍵[3]。低溫馴化、黑暗培養等也是超低溫保存常用的預處理方法。

2.2.1干燥 材料含水量是決定超低溫保存能否成功的關鍵。含水量過高植物內易形成冰晶造成機械性損傷；含水量過低會對植物組織細胞內的束縛水進行破壞，造成組織死亡。適當的脫水能減少細胞的損害，提高材料成活率[5]。常維霞等[6]對油茶花粉含水量的超低溫保存效果進行了研究，結果表明經脫水處理后，花粉活性隨含水量降低而降低，液氮保存后的花粉萌發率均先升高后下降，油茶花粉經過3～5 h脫水，含水量為14.46%～15.70%時保存效果最好。曾琳等[7]研究表明，降香黃檀種子超低溫保存后發芽率和生活力隨著含水量的變化而變化，當降香黃檀種子含水量由 15.04%降至 8.14%時，其發芽率由82.67%下降至18.35%，生活力由 85.0%降至25.0%，超低溫保存效果最好的條件是種子含水量為 15.04%。在花粉的保存中也有類似研究，當桃葉衛矛花粉在含水量為14.56%的初始狀態時，液氮保存后的花粉全部死亡，當含水量降低到4.14%～12.32%時，花粉的萌發率呈現逐漸升高的趨勢，而當花粉含水量降至1.67%時，花粉萌發率又開始下降，最終全部死亡[8]。因此，含水量與超低溫保存材料的萌發率關系緊密，是超低溫保存能否成功的關鍵因素。

2.2.2低溫馴化及暗培養 低溫鍛煉又稱冷馴化，通常是指將生物材料置于4～10 ℃低溫處理，可以提高藥用植物的抗凍能力。低溫可以激活藥用植物體內的抗寒機制，通過一定時間的低溫暗培養馴化，可以有效提高細胞膜磷脂的不飽和程度和藥用植物體內多胺和脯氨酸的含量，誘導細胞產生抗凍蛋白[9]，發生保護性脫水，提高植物的成活率。但是低溫馴化時間過長會造成的試管苗成活率下降、葉片枯黃脫落等現象，可能是由于在冰箱的低溫暗培養中，植物缺少光照、生活力減弱，導致植物超低溫保存后成活率下降。研究表明香石竹植株在4～8 ℃馴化后凍存，成活率達70%～80%[10]；懷山藥在低溫鍛煉7 d時成活率達最大值[11]；薄濤等[12]將繼代生長30 d的蛇莓試管苗于4 ℃冰箱中低溫鍛煉0、1、2、3、4、5、6周，經超低溫保存后發現，鍛煉4周時蛇莓莖尖保存后成活率達到(28.00±5.70)%，未經鍛煉的莖尖存活率僅為(7.00±2.74)%，但隨鍛煉時間延長，保存后莖尖存活率呈下降趨勢，鍛煉5～6周時，試管苗逐漸變黃脫葉，成活率顯著下降。因此，要合理控制低溫馴化時間。

2.3 保護劑的使用

藥用植物材料的脫水時間具有種間特異性，根據不同藥用植物的保存部位，通過改變裝載時間、冰凍保護劑、脫水時間、化凍方法等可得到適宜的冷凍保存方法。冷凍保護劑的使用是為了避免在冷凍過程中形成細胞內冰晶，同時可以弱化水結晶,確保溶液呈高冷狀態，但其對植物均有一定的毒害作用，作用時間過長會造成細胞過度脫水，成活率下降[13]。目前應用最廣泛的冷凍保護劑是PVS2。

李俊慧等[14]將不同玻璃化液處理的香蕉莖尖超低溫保存后的再生率進行對比，發現PVS2效果最好，其次是PVS4，但PVS4處理的結果穩定性不好。枇杷莖尖的超低溫保存結果表明，莖尖在PVS2處理50 min時成活率最高，可達50.3%，少于50 min時由于莖尖脫水不完全而成活率不高，超過50 min則受到PVS2毒害也不易成活[15]。在馬鈴薯莖尖的研究結果類似，王家福等[16]發現在60%PVS2處理30 min后的莖尖成活率最高，達到71.6%，處理40 min后成活率為70.4%，50 min的成活率為68.3%。而對櫻桃砧木馬哈利離體莖尖的超低溫保存研究結果表明PVS3效果較好[17]。不同植物所用冰凍劑的作用時間以及濃度等都需要深入研究。

2.4 凍存方法

藥用植物超低溫保存凍存方法有兩步降溫法、逐步冷凍法、干燥凍存法、脫水凍存法、玻璃化法、包埋玻璃化法等。各種冷凍方法有各自的優缺點，在保存實驗過程中應根據不同材料來確定冷凍方法。如對菊花莖尖來說，最適宜的方法可能是小液滴快速冷凍法，而甘薯最適宜的超低溫保存方法是玻璃化法。

2.5 化凍方法

據目前的研究來看，大多數藥用植物超低溫保存材料選擇快速化凍效果較好，化凍過程中隨著溫度的升高細胞內易形成二次結冰。冰晶最易在-50～-10 ℃時形成，此時如果解凍速度太慢，細胞內更多的自由水會發生重結晶，從而加大對細胞的損傷。選擇適當的解凍方法可提高超低溫保存藥用植物的萌發率和復蘇率。尚曉倩等[18]對超低溫保存后的牡丹花粉采用4種化凍方法，即分別采用自來水沖洗10 min、室溫(24 ℃)化凍、30 ℃溫水浴及40 ℃溫水浴解凍，結果表明30 ℃溫水浴化凍的花粉萌發率顯著高于其他幾種方式。庫車小白杏莖尖愈傷材料在室溫下解凍的成活率最低，僅為6%，而采用40 ℃水浴5 min解凍和4 ℃冰箱解凍的成活率較高，分別為90%和84%[19]。大葉黑桫欏在室溫下化凍的孢子萌發率為47.6%～65.3%，明顯高于37 ℃水浴化凍條件下的孢子萌發率[20]，而懷山藥莖尖在40 ℃化凍溫度時復蘇率最高[11]。對于超低溫保存的扁桃晚豐18號的花粉來說，最佳的化凍方式是35 ℃解凍70 s，花粉萌發率高達63.09%[21]。

3 藥用植物超低溫保存現狀

超低溫保存作為植物離體保存最重要的技術之一，國內外已對數百種植物材料進行了超低溫保存[22]。涉及保存的材料也很眾多，有原生質體、懸浮細胞、愈傷組織、體細胞胚、花粉、莖尖分生組織等，甚至植株幼苗[2]。目前，中國、美國、法國、德國等也已建立植物種質資源的超低溫保存庫，對農作物和園林植物的材料進行超低溫保存，并取得了較為理想的效果。但是，超低溫應用范圍還非常有限，尤其在藥用植物的保存方面報道較少，更沒有專門的藥用植物超低溫種質資源庫。已知超低溫保存成功的藥用植物材料有百子蓮胚性愈傷組織、大苞鞘石斛原球莖、人參叢生芽、金銀忍冬花粉及莖尖、降香黃檀種子等[23-36]，但還有很多珍稀瀕危藥用植物尚無進行超低溫保存的報道。近年來，學者們對超低溫保存前后藥用植物材料做了一些對比研究和分析，目前的研究主要集中在材料形態[23-37]、細胞[20，36]等方面，對不同基因型藥用植物、不同保存類型材料及超低溫保存機理研究較少，偶見對保存材料進行分子和遺傳穩定性[1，38]考察的文獻，缺乏真正系統的深入研究。藥用植物超低溫保存常用方法和路線見圖1。

圖1 藥用植物超低溫保存常用方法和路線

4 問題與展望

超低溫保存已成為目前種質資源保存的研究熱門技術[39-41]。大規模使用超低溫技術還存在以下問題：1)超低溫保存技術應結合植物的種間差異性研究；2)冰凍保護劑的使用及優化；3)化凍處理方法的研究；4)影響因素較多；5)超低溫理論化的進一步發展。但隨著低溫生物學的發展以及各學科相互借鑒和滲透，超低溫保存技術的研究將會不斷完善和深入。超低溫保存藥用植物種質資源最主要的目的是保證其遺傳穩定性，控制遺傳性狀的基因不發生突變，因此保存前后材料的遺傳穩定性對比研究非常重要。對藥用植物而言，超低溫保存后復蘇材料的有效成分和藥理活性的對比研究也將是未來超低溫保存的重要考察點。另外，雖然理論上超低溫技術能夠實現種質資源的“永久保存”，但由于超低溫保存技術發展時間較短，其保存的極限時間仍需更長的時間來驗證。

藥用植物種質資源多是重要的特有野生資源，其保存工作尤為重要。超低溫保存技術是現今最經濟、安全、有效的保存手段，擴大其應用范圍是保護珍稀瀕危藥用植物種質資源的必然趨勢，成立國家和地方藥用植物種質資源超低溫保存庫勢在必行。未來應深入探究超低溫保存的原理，將超低溫保存技術與生產實踐有效的結合，參與藥用植物脫毒栽培、品種選育及種質創新工作以解決珍稀瀕危藥用植物種質保存工作中的難題。