鈉通道Nav1.8 在瑞芬太尼誘發大鼠痛覺過敏中的作用

阮家信 藍雨雁（通訊作者）

（廣西醫科大學第一附屬醫院麻醉科 廣西 南寧 530021）

瑞芬太尼在臨床麻醉中廣泛應用，但存痛覺過敏副作用[1]。Nav1.8 通道在痛性刺激的外周敏感化中起效應。因此Nav1.8 可能成為防治慢性疼痛及炎性導致的痛過敏化的新途徑。通過對誘發痛過敏的大鼠模型使用Nav1.8 拮抗劑（A 803467）及羅哌卡因處理，研究大鼠的背根的神經節（即DRG）的Nav1.8 通道于瑞芬太尼及切口痛模型中導致痛過敏化時的潛在功能。

1.資料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

瑞芬太尼（湖北省宜昌人福藥業）、0.75% 羅哌卡因（阿斯利康）、Na+通道拮抗劑（西格瑪奧德里奇）、手術器械（廣西博仁生物）。

1.2 實驗動物及分組切口痛模型建立

雄性SD 大鼠260 ～320 g48 只（本校動物中心）。隨機分6 組： C 組靜脈泵注0.9%生理鹽水；RIA 組、RA 組靜脈注射A-803467，10 min 后RIA 組行切口痛手術，RA 組、RIA 組靜脈泵注瑞芬太尼；R 組、RI 組靜泵瑞芬太尼，持續2 h，同時RI 組行手術。RIL 組經腰椎3 ～4 間隙注射羅哌卡因后，泵注瑞芬太尼2h，行手術。按Brennan TJ[2]等建立大鼠切口疼痛模型。分別測各組大鼠熱痛閾：未置管T0，未給藥T1，給藥時間0.5 小時(T2)、1 小時(T3)、2 小時(T4)及停藥后0.5 小時(T5)，各時間點分別測量各組熱痛覺閾值。

1.3 RT-PCR 法檢測大鼠DRG 內Nav1.8 mRNA 表達

提鼠DRG 的總RNA，并用逆轉錄試劑盒合成cDNA，PCR 擴增產物。

引物序列：

Nav1.8 通道：

上游：5'-GGACTCCCTGAAGACCAATATGGAAG-3'

下游：5'-GCATTGAGCTAGATGGGTTAATGTTG-3'

β-actin：

上游：5'-AGATGTACGTAGCCATCC-3'

下游：5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'

反應條件：

Nav1.8：94 ℃預 變 性5min；40 循 環，92 ℃ 30s，58 ℃ 30s,72℃ 1min；72℃延伸10 min。

β-actin：94℃預變性5min；40 循環，92℃ 30s，60℃ 30s,72℃ 1min；72℃延伸10min。

1.5 免疫組化法檢測大鼠DRG 上Nav1.8 的表達

大鼠DRG 組織置4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定，然后石蠟包埋并冰凍切片，行免疫組化染色后鏡下觀察。

1.6 統計學分析

數據采用SPSS16.0統計學軟件分析處理，計數資料采用率（%）表示，行χ2檢驗，計量資料用均數±標準差（±s）表示，行t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 熱痛閾值

比較T0、T1 各組動物體重及熱痛閾均無統計學意義。在不同時間（T4、T2、T3)，RIA、R、RI、RA 及RIL 組熱痛閾較C 組明顯升高。T5 時間點，RI、R、RA、RIA 組大鼠的熱痛閾較C 組下降 ；RIL 組熱痛閾值無顯著差異；其中R 組與RI 組比較大鼠熱痛閾值升高，與RA組比較熱痛閾值下降，差異具有統計學意義；RI 組大鼠熱痛閾值均低于RIA 組和RIL 組；RIA 組大鼠熱痛閾值低于RIL 組，P＜0.05，見表1。

表1 各組大鼠不同時間點熱痛覺閾值（±s）

表1 各組大鼠不同時間點熱痛覺閾值（±s）

注：與C 組比較，0.05；與R 組比較0.05；與RI 組比較0.05；與RIA 組比0.05

組別 只數 T0 T1 T2 T3 T4 T5 C 8 4.19±0.21 4.03±0.25 4.13±0.93 4.09±0.15 3.95±0.36 4.06±0.49 R 8 3.70±0.18 3.69±0.46 11.34±0.72 11.09±1.15 11.21±0.90 2.41±0.15 RI 8 3.91±0.47 3.79±0.21 11.15±0.61 10.96±0.11 11.17±0.12 2.25±0.16 RA 8 4.04±0.35 3.98±0.19 12.07±0.12 12.10±0.42 12.15±0.14 2.64±0.11 RIA 8 3.93±0.17 3.82±0.28 11.32±0.16 10.97±0.32 11.15±0.19 2.55±0.26 RIL 8 3.82±0.28 3.70±0.51 16.00±0.00 16.00±0.00 11.61±0.09 3.99±0.87

2.2 Nav1.8mRNA 與蛋白表達分析

與C 組比較，RI、R 組Nav1.8mRNA 表達明顯增加，RA、RIA、RIL 組Nav1.8mRNA 表達下降；其中R 組Nav1.8mRNA 表達與RI 組比較下降，與RA 組比較升高，RI 組的Nav1.8mRNA 表達高于RIA、RIL 組。Nav1.8 通道表達增高；RA、RIA、RIL 組的Nav1.8 通道表達減少；R 組Nav1.8 通道表達與RI 組比降低，比RA 組升高；RI 組Nav1.8 通道表達高于RIA、RIL 組；RIA 組Nav1.8 通道表達高于RIL 均P＜0.05，見表2。

表2 各組大鼠DRG 上Nav1.8mRNA 及蛋白表達的比較（±s）

表2 各組大鼠DRG 上Nav1.8mRNA 及蛋白表達的比較（±s）

注：與C 組比較，0.05；與R 組比較0.05；與RI 組比較0.05；與RIA組比P ＜0.05

組別 Nav1.8mRNA Nav1.8 蛋白C 1.18±0.07 0.19±0.02 R 2.91±0.43 0.44±0.08 RI 3.71±0.15 1.08±0.06 RA 0.44±0.05 0.11±0.03 RIA 0.62±0.10 0.14±0.02 RIL 0.29±0.03 0.08±0.01

3.討論

本研究表明，靜脈使用瑞芬太尼可導致大鼠切口術后痛覺過敏化。同時RT-PCR 及免疫組化結果顯示，此時模型脊髓的背根神經元（即DRG）的鈉離子通道Nav1.8 的mRNA 和蛋白均有升高。我們使用瑞芬太尼可加深RI 組大鼠切口痛模型術后的痛過敏現象，且切口痛大鼠模型DRG 上的Nav1.8mRNA 及蛋白的表達比R 組明顯升高，說明Nav1.8 通道參與了瑞芬太尼及瑞芬太尼-切口痛相關術后痛過敏的發生及發展。我們的研究也顯示，經大鼠腰3、4 間隙注射羅派卡因后瑞芬太尼-切口痛相關痛過敏效應得到明顯緩解，此時測量RIL 組大鼠模型脊髓神經元DRG 上鈉離子通道Nav1.8 的mRNA 及蛋白表達，呈顯著下降或幾乎不表達，我們推測其原理可能為：通過硬膜外隙，羅哌卡因作用于大鼠背根的鈉離子通道，阻滯DRG 神經元上鈉離子通道，Nav1.8 通道的表達下調，使其去極化、復極化速率減少，延長了通道不應期，降低了神經細胞興奮性和閾值，這就阻斷了來自外周的痛刺激信號傳入，通過降低中樞神經細胞的過敏化，從而減少了痛過敏現象的發生[3，4，5]。本研究中，C 組的大鼠熱痛閾同RIL 組的比較沒有顯著的差別，顯示了羅哌卡因的使用阻滯了大鼠的瑞芬太尼-切口痛的術后痛過敏現象；鈉通道Nav1.8 拮抗劑A-803467 的使用，也減少了大鼠瑞芬太尼-切口痛模型的術后痛過敏現象，但RIA 組依舊發生了痛過敏現象；且鈉離子通道在RIL 組動物DRG 上表達很少，這就說明存在其他的非Nav1.8 的Na+通道，同時參與大鼠切口痛模型的痛過敏現象的過程。