牦牛乳與荷斯坦牛乳硬質干酪的抗氧化特性比較

楊 靜,梁 琪,宋雪梅,張 炎

（甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅省功能乳品工程實驗室,甘肅 蘭州 730070）

干酪是一種風味獨特、營養(yǎng)豐富、耐貯性良好的發(fā)酵性乳制品,是乳品營養(yǎng)物質的濃縮[1-2]。硬質干酪是國際乳品工業(yè)加工中主要干酪品種,需要數月甚至兩年的成熟期進行風味的積累,這是一個相當復雜的微生物及生化變化過程。在成熟過程中,脂肪氧化降解形成氧化降解產物,這些氧化降解產物很大程度上決定干酪的品質。在成熟期干酪中本身存在一些天然抗氧化因子,它們具有很強的抗氧化作用,能夠使整個體系的氧化程度降低,這可能也是硬質干酪成熟期較長的一個重要原因。Batool等[3]在研究中發(fā)現,VE和硒能提高切達干酪的抗氧化能力,并且能阻遏其發(fā)生脂質氧化；曲秀偉[4]的研究表明切達干酪在益生菌的作用下能夠產生具有抗氧化活性的小分子多肽；Liu Lu等[5]研究普通全脂牛乳切達干酪水溶性提取物的抗氧化活性,發(fā)現隨成熟時間的延長,該提取物表現一定的抗氧化特性。這些結論驗證了干酪中抗氧化因子在脂質氧化過程中的重要性。

Giannoglou等[6]研究指出降低干酪脂肪含量導致成熟過程中脂肪參與代謝積累的揮發(fā)性風味化合物的種類和數量減少。O'mahony等[7]研究還發(fā)現使用脂肪粒徑和孔隙較大的乳制成的干酪,成熟過程中氧化較為迅速且游離脂肪酸含量顯著較高。Ewe等[8]研究發(fā)現經過發(fā)酵后的乳脂肪生物活性物質（如抗氧化物質）的含量更高。Murtaza等[9]研究表明,不同種源牛乳脂肪的種類和數量存在較大的差異,不同來源的牛乳脂肪氧化程度有顯著差異,牦牛乳脂質、蛋白質和干物質含量均高于其他普通牛乳,利用牦牛乳制成的硬質干酪其脂質、蛋白質和干物質含量也高于普通牛乳制成的硬質干酪,其營養(yǎng)價值和風味也不同。Revilla等[10]通過研究山羊乳、母羊乳和牛乳制成的干酪,發(fā)現不同乳源的干酪中其抗氧化能力有顯著差異,且不同原料制成的干酪其抗氧化能力與脂肪和蛋白質含量均呈現正相關。Perna等[11]對意大利棕色牛乳干酪和荷斯坦牛乳干酪進行研究,發(fā)現意大利棕色牛乳干酪比荷斯坦牛乳干酪具有更高的抗氧化活性,并且兩種干酪的抗氧化活性在干酪成熟期間都有所增加。

牦牛作為青藏高原特有的品種,放牧環(huán)境使牦牛乳營養(yǎng)物質和天然抗氧化成分含量與普通牛乳有明顯差異,抗氧化物質對硬質干酪成熟過程中的氧化穩(wěn)定性具有重要的作用。牦牛乳硬質干酪在成熟過程中乳脂含量與乳脂氧化速率呈現的規(guī)律鮮有報道。本實驗以甘肅天祝縣抓喜秀龍鄉(xiāng)牦牛乳和甘肅農業(yè)大學奶牛場荷斯坦牛乳為原料制作硬質干酪,分別測定成熟期6 個月內（0、1、2、3、4、5、6 個月）脂肪氧化程度并探討其變化規(guī)律。通過測定酸度值（acidity value,ADV）、羰基價（carbonyl value,CV）、過氧化值（peroxide value,POV）和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA）值,比較牦牛乳硬質干酪和荷斯坦牛乳硬質干酪在成熟期間脂肪氧化的程度與速率,探討硬質干酪乳脂含量與氧化速率的規(guī)律,以期為乳脂氧化機理的研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳采自甘肅天祝縣抓喜秀龍鄉(xiāng)；新鮮荷斯坦牛乳采自甘肅農業(yè)大學奶牛場。

小牛皺胃酶（活力為10萬單位/g） 蘭州百靈生物技術有限公司；發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）丹麥丹尼斯克公司；實驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-5100分光光度計 上海光譜儀器有限公司；pHS-3C酸度計 上海精密儀器有限公司；RE52-98旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TGL-20高速離心機長沙平凡儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硬質干酪的加工

新鮮原料乳經檢驗合格后分裝,經巴氏殺菌后冷卻至35 ℃,隨即加入已活化的發(fā)酵劑,大約1 h后測其pH值,當pH值降至6.2時緩慢加入0.3 g/L CaCl2并慢速攪拌,10 min后加入0.67 g/L凝乳酶,2 h后利用乳酸降酸至pH 5.6,切割、排乳清,加入2%凝塊質量的食鹽、堆釀約2 h、放入壓榨槽內進行壓榨并包裝,置于4 ℃恒溫冰箱中分別成熟0、1、2、3、4、5、6 個月,待成熟后進行各項指標的測定。

1.3.2 干酪出品率及脂肪含量的測定

1.3.2.1 干酪出品率的測定

分別稱量鮮奶、鮮干酪（即成品干酪）以及發(fā)酵劑質量,按照式（1）計算干酪出品率。

1.3.2.2 乳脂質量分數的測定

采用GB/T 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中測定方法。稱取干酪樣品2 g,加入8 mL水混勻,加入10 mL 2 mol/L鹽酸溶液,在70～80 ℃水浴條件下消化完全。加入10 mL無水乙醇混勻,冷卻后分次加入25 mL無水乙醚,振搖1 min后靜置12 min,再次用無水乙醚沖洗附著在容器上的脂肪,靜置20 min,吸取上清液于已恒質量的錐形瓶中,再次用5 mL無水乙醚洗滌容器,振搖后靜置,將乙醚層吸出與之前乙醚層合并,水浴蒸干,再于（100±5）℃下干燥1 h,置于干燥器內冷卻,恒質量后稱量。樣品的乳脂質量分數按式（2）進行計算。

式中：m1為恒質量后接收瓶和脂肪的質量/g；m0為接收瓶的質量/g；m2為樣品的質量/g。

1.3.3 氧化指標的測定

1.3.3.1 ADV的測定

采用Katsiari等[12]的方法并加以改進。稱取干酪樣品,加入石油醚-乙醇（2∶1,V/V）混合液,均質,過濾,加入酚酞指示劑,用0.1 mol/L氫氧化鉀-乙醇標準溶液滴定至終點。樣品的ADV按式（3）進行計算。

式中：ADV為中和1 g干酪樣品中游離脂肪酸所需氫氧化鉀的質量,單位mg/g；V為干酪樣品消耗氫氧化鉀標準溶液的體積/mL；c為氫氧化鉀-乙醇標準溶液的濃度/（mol/L）；m為干酪樣品的質量/g。

1.3.3.2 CV的測定

采用GB/T 5009.230—2016《食品安全國家標準 食品中羰基價的測定》中測定方法。稱取干酪樣品,加入5 mL精制苯溶液溶解樣品,再分別加入3 mL三氯乙酸溶液和5 mL 2,4-二硝基苯肼溶液并搖勻。置于60 ℃水浴中30 min,冷卻后緩慢加入0.05 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液,搖勻后放置10 min。用不加樣品的空白試劑調零分光光度計,于440 nm波長處測吸光度。干酪樣品的CV按式（4）進行計算。

式中：A為干酪樣品溶液的吸光度；m為干酪樣品的質量/g。

1.3.3.3 POV的測定

參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》的測定方法,并加以改進。稱取干酪,加入冰乙酸與異辛烷混合溶液（6∶4,V/V）50 mL,混勻,準確量取飽和碘化鉀溶液0.5 mL,振搖,放置暗處3～5 min后立即加入30 mL蒸餾水搖勻,用0.002 mol/L硫代硫酸鈉標準溶液滴定至淡黃色,準確量取10 g/L淀粉溶液0.5 mL,溶液變?yōu)樗{色,繼續(xù)用硫代硫酸鈉標準溶液滴定至藍色消失。同時不加樣品做空白實驗。干酪樣品的POV按式（5）進行計算。

式中：V為滴定干酪樣品所消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積/mL；V'為滴定空白組試樣消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積/mL；c為硫代硫酸鈉標準溶液的濃度/（mol/L）；m為干酪樣品的質量/g。

1.3.3.4 TBA值的測定

采用Aryee[13]和Salih[14]等的方法,并加以改進。稱取三氯乙酸7.5 g、乙二胺四乙酸0.1 g,用蒸餾水溶解并定容至100 mL待用,稱取干酪樣品,水浴條件下加入上述混合液50 mL,均質5 min,用雙層濾紙過濾兩次。取濾液5 mL,加入TBA溶液,90 ℃水浴40 min,冷卻后離心,取上清液并加入三氯甲烷,分層,取上清液分別于532 nm和600 nm波長處測定吸光度,以不加樣品的空白試劑調零。干酪樣品的TBA值按式（6）進行計算。

式中：A532nm為樣液在532 nm波長處的吸光度；A600nm為樣液在600 nm波長處的吸光度。

1.4 數據處理與分析

采用Excel軟件進行數據處理,各項指標的結果均采用3 次重復,以平均值±標準差表示,用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析（Duncan法）。

2 結果與分析

2.1 干酪乳脂質量分數及出品率

表1 不同乳源干酪乳脂質量分數及出品率Table 1 Yield and fat content of cheese made from different milk sources

原料乳、凝乳酶和發(fā)酵劑的類型和添加量以及CaCl2的添加量對干酪的產量、品質等具有重要影響[15]。牦牛乳和荷斯坦牛乳硬質干酪乳脂質量分數分別為（49.96±2.48）%和（29.86±2.16）%,出品率分別為（19.76±0.18）%和（12.10±0.10）%（表1）。牦牛乳硬質干酪的乳脂質量分數比荷斯坦牛乳硬質干酪高出17.10%,出品率是荷斯坦牛乳硬質干酪的1.63 倍。研究發(fā)現,牦牛乳中蛋白質、乳脂肪及干物質含量均高于荷斯坦牛乳,并且脂肪球粒徑也更大。高婉偉等[16]研究得出牦牛乳的脂肪含量為7.01 g/100 g、蛋白質含量為5.24 g/100 g、干物質含量為17.86 g/100 g；荷斯坦牛乳脂肪含量為3.40 g/100 g、蛋白質含量為3.40 g/100 g、干物質含量為12.75 g/100 g。鐘光輝等[17]研究得出的牦牛乳脂肪球粒徑（4.39 μm）遠大于王風梅等[18]研究得出的荷斯坦牛乳脂肪球粒徑（3.16 μm）,脂肪球粒徑越大,其乳脂含量相對較高,干酪的出品率越高[18]。

2.2 成熟期內乳脂肪游離脂肪酸ADV和CV的變化

2.2.1 游離脂肪酸ADV的變化

表2 不同乳源干酪成熟期間ADV變化Table 2 Changes in ADV of cheese made from different milk sources during ripening

ADV反映游離脂肪酸的含量,用來判斷干酪中脂肪的水解程度。ADV在干酪成熟期間的變化如表2所示。兩種干酪在成熟過程中ADV均呈現增大趨勢,干酪在成熟過程中脂肪的水解不斷進行。Amer等[19]研究也發(fā)現乳中存在的天然乳脂蛋白脂酶會催化乳脂肪分解并引起游離脂肪酸水平的顯著增加。0 個月時,牦牛乳硬質干酪與荷斯坦牛乳硬質干酪ADV分別為1.71 mg/g和1.30 mg/g,成熟6 個月時,牦牛乳硬質干酪ADV為6.24 mg/g,略高于荷斯坦牛乳硬質干酪ADV（6.04 mg/g）（P＞0.05）。通過擬合線性回歸方程分別得出兩種干酪在成熟期間0～6 個月ADV的線性方程,牦牛乳硬質干酪線性方程：Y＝0.756 9x+1.157 3（R2＝0.980 4）；荷斯坦牛乳硬質干酪線性方程：Y＝0.756 7x+0.470 8（R2＝0.986 8）。2.2.2 CV的變化

表3 不同乳源干酪成熟期間CV變化Table 3 Changes in CV of cheese made from different milk sources during ripening

CV代表產物過氧化物形成后進一步分解的含羰基化合物的量,是反映脂質氧化程度的重要指標[20]。由表3可知,兩種干酪在成熟期間CV持續(xù)增加。當成熟期到達3 個月,牦牛乳硬質干酪CV達到0.54 meq/kg,顯著高于荷斯坦牛乳硬質干酪（0.48 meq/kg）,在3 個月時牦牛乳硬質干酪中形成的過氧化物相對較多,并分解為許多含羰基化合物。兩種干酪的CV在成熟過程中的變化趨勢與巨玉佳等[21]研究的牦牛乳硬質干酪的變化趨勢大體相近,均呈現出整體上升的狀態(tài),表明干酪在成熟期間脂肪的氧化持續(xù)進行,兩種干酪在1、2、4、5、6 個月時CV之間差異不顯著（P＞0.05）,而0 個月與3 個月時兩種干酪間CV差異顯著（P＜0.05）。通過擬合線性回歸方程分別得出兩種干酪在成熟期間0～6 個月CV的線性方程,牦牛乳硬質干酪線性方程：Y＝0.133 8x+0.003 9（R2＝0.967 9）；荷斯坦牛乳硬質干酪線性方程：Y＝0.131 2x-0.003 9（R2＝0.975 3）。

2.3 成熟期內乳脂肪POV的變化

表4 不同乳源干酪成熟期間POV變化Table 4 Changes in POV of cheese made from different milk sources during ripening

POV是反映脂肪氧化程度的主要指標,也是脂肪氧化初級評價指標,即一級氧化指標,是氧與不飽和脂肪酸的雙鍵反應形成的中間氧化產物[22]。干酪在成熟期間POV變化如表4所示。兩種干酪的POV在成熟初期急劇升高,牦牛乳干酪在3 個月時達到最大值（1.02 mmol/kg）,相比0 個月時的POV增加了0.62 mmol/kg,增幅約為155%；荷斯坦牛乳干酪于4 個月時達到最大值（1.01 mmol/kg）,相比第0個月時增加了0.59 mmol/kg,增幅約為140%。在干酪成熟的早期階段,脂肪中的主要過氧化物積累,POV急劇上升。當一級產物醛酮類物質和烴類化合物的積累量與一級產物所生成的小分子物質（羧酸類化合物）的量達到一個臨界點時,一級產物的積累速率降低,一級產物進一步生成小分子物質的速率加快,POV開始降低,當產生過氧化物的增加量與進一步生成小分子物質的消耗量趨于平衡時,POV逐漸趨于穩(wěn)定[23]。由于牦牛乳硬質干酪的脂肪含量高于荷斯坦乳硬質干酪,牦牛乳硬質干酪的POV總體上高于荷斯坦牛乳干酪,后期（4～6 個月）牦牛乳與荷斯坦牛乳硬質干酪的POV并沒有顯著性差異（P＞0.05）,很可能是因為牦牛乳硬質干酪的抗氧化因子更高,阻遏了其氧化增速。通過擬合回歸方程分別得出兩種干酪在成熟期0～6 個月POV的擬合方程,牦牛乳硬質干酪方程：Y＝-0.001 7x5+0.038 2x4-0.336 6x3+1.347 7x2-2.146 7x+1.496 9（R2＝0.993 2）；荷斯坦牛乳硬質干酪方程：Y＝0.002 5x5-0.049 4x4+0.334 6x3-0.962 5x2+1.253 9x-0.157（R2＝0.981 1）。

2.4 成熟期內乳脂肪二級氧化程度TBA值的變化

表5 不同乳源干酪成熟期間TBA值變化Table 5 Changes in TBA values of cheese made from different milk sources during ripening

TBA值是反映脂肪進一步氧化程度的主要指標,根據TBA值可以推斷干酪脂肪的二級氧化程度。成熟過程中兩種干酪的TBA值變化如表5所示。在成熟6 個月時牦牛乳硬質干酪和荷斯坦牛乳硬質干酪TBA值分別為0.277 mg/kg和0.262 mg/kg。兩種干酪在成熟期內TBA值均呈現較低水平,并且上升幅度不大。牦牛乳硬質干酪與荷斯坦牛乳硬質干酪的二級氧化速率在成熟3、4 個月時差異顯著（P＜0.05）,在成熟5、6 個月時差異不顯著（P＞0.05）。通過擬合線性回歸方程分別得出兩種干酪在成熟期間0～6 個月TBA值的線性方程,牦牛乳硬質干酪線性方程：Y＝0.034 3x+0.024 4（R2＝0.968 8）；荷斯坦牛乳硬質干酪線性方程：Y＝0.032 3x+0.017（R2＝0.939）。

2.5 兩種干酪成熟期間各指標總增幅及平均增長速率

2.5.1 游離脂肪酸ADV和CV總增幅及平均增長速率

圖1 兩種干酪成熟期間ADV（A）和CV（B）總增幅及平均增長速率Fig.1 Total increments and average growth rates of ADV (A) and CV (B)in two cheeses during ripening

由圖1可知,兩種干酪在成熟期間各指標的總增幅不同。牦牛乳硬質干酪的ADV在0～6 個月的總增幅為263.94%,荷斯坦牛乳干酪的總增幅為363.91%,高出牦牛乳硬質干酪99.97%,牦牛乳硬質干酪的乳脂含量比荷斯坦牛乳干酪高,但是其在成熟期間ADV總增幅卻比荷斯坦干酪低,其在成熟期間平均增長速率為0.754 4 mg/（g·月）,略低于荷斯坦牛乳硬質干酪的平均增長速率0.790 5 mg/（g·月）。牦牛乳干酪在成熟期間CV的總增幅為455.22%,荷斯坦干酪為524.56%,兩種干酪CV平均增長速率分別為0.140 0 meq/（kg·月）和0.138 5 meq/（kg·月）,由此可以看出兩種干酪CV的平均增長速率相差不明顯,并且牦牛乳干酪在3～6 個月的增幅為87.58%,而荷斯坦牛乳干酪為108.54%,出現了后期增幅降低的情況。

2.5.2 一級氧化程度POV和二級氧化程度TBA值總增幅及平均增長速率

由圖2可知,牦牛乳干酪和荷斯坦牛乳干酪在成熟期間POV總增幅分別為33.63%和12.86%,POV平均增長速率分別為0.022 3 mmol/（kg·月）和0.008 3 mmol/（kg·月）,牦牛乳干酪的總增幅和平均增長速率均高于荷斯坦牛乳,但是在6 個月時,牦牛乳干酪和荷斯坦牛乳干酪POV差異不顯著（表4）,這就說明在6 個月時,兩種干酪的氧化程度大體是一致的,并且在3～6 個月時,牦牛乳POV的增幅為-48.03%,而荷斯坦干酪為-40.17%,明顯較牦牛乳干酪POV降幅較緩；TBA值在成熟期間牦牛乳硬質干酪的總增幅為330.48%,荷斯坦牛乳干酪為335.89%,牦牛乳和荷斯坦牛乳干酪的平均增長速率分別為0.035 4 mg/（kg·月）和0.033 6 mg/（kg·月）,平均增長速率大體相當,兩種干酪在3～6 個月時的總增幅分別為54.68%、91.82%,牦牛乳干酪依舊呈現一個后期低增長和低速率的趨勢。

圖2 兩種干酪成熟期間POV（A）和TBA值（B）總增幅及平均增長速率Fig.2 Total increments and average growth rates of POV (A) and TBA value (B) in two cheeses during ripening

總體來說,牦牛乳硬質干酪的乳脂含量較荷斯坦牛乳硬質干酪高,但是其在成熟期間的平均氧化速率和總增幅卻比荷斯坦牛乳硬質干酪低。值得注意的是牦牛乳硬質干酪在0～3 個月CV、POV、TBA的增長速率和增幅均比荷斯坦高,但是在3～6 個月,這3 個氧化指標的增幅和速率卻較荷斯坦牛乳硬質干酪低,這就說明牦牛乳硬質干酪后期的氧化慢于荷斯坦牛乳干酪。結合國內外文獻,造成這種現象的主要原因是牦牛乳干酪比荷斯坦牛乳干酪中存在更多的抗氧化因子。其中乳中自帶的一些抗氧化成分如維生素（包括核黃素、視黃醇、生育酚、胡蘿卜素等）[24]、多肽、脂肪酸等生物活性物質[25]、抗氧化酶（包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等）[26],還有一些極性脂質（如磷脂等）起到重要的抗氧化作用[27]。Suo Huayi等[28]研究得出乳源性抗氧化物質具有阻止自由基生成、清除已形成的自由基和活性氧的功能。烏仁圖雅等[29]研究發(fā)現乳通過發(fā)酵后可以進一步促進抗氧化物質的釋放,而發(fā)酵產生的一些衍生物不僅可以清除自由基,還可以提高細胞中過氧化氫酶活性和谷胱甘肽的水平,這使得干酪的抗氧化活性遠高于液態(tài)乳。Revilla[10]與Lucas[30]等研究發(fā)現,干酪的抗氧化能力與某些抗氧化物質（蛋白質、視黃醇、礦物質、VA、VE、β-胡蘿卜素）的含量呈正相關,并且得出干酪的抗氧化能力與乳脂含量呈正相關,即乳脂含量越多,其中所含的脂溶性抗氧化物質也更多,干酪的抗氧化性能更加顯著。Revilla等[31]發(fā)現脂溶性抗氧化物質的含量與動物的飼養(yǎng)方式也有著密不可分的關系,飼喂或者放牧食用新鮮牧草的動物比飼喂飼料的動物乳脂中所含脂溶性物質豐度更高。Songisepp等[32]發(fā)現益生菌干酪的抗氧化活性隨成熟時間的延長呈現增加趨勢。由此可見,牦牛乳干酪中所含的脂溶性抗氧化物質豐度可能更高,牦牛乳干酪成熟后期的氧化速率慢,主要是這些抗氧化物質在成熟的后期起到了關鍵性的作用。本實驗發(fā)現牦牛乳硬質干酪的乳脂氧化呈現高乳脂低氧化現象,為進一步揭示其影響因子和機理提供參考。

3 結 論

本研究比較了牦牛乳與荷斯坦牛乳硬質干酪的抗氧化特性,結果發(fā)現,牦牛乳硬質干酪中乳脂含量雖高,但是在整個成熟期間牦牛乳硬質干酪氧化指標總增幅和平均增長速率較荷斯坦牛乳硬質干酪小,說明牦牛乳硬質干酪在整個成熟期間脂肪的氧化速率較荷斯坦牛乳硬質干酪慢,這是因為牦牛乳硬質干酪中含有較多的抗氧化因子。在后期3～6 個月時,牦牛乳硬質干酪乳脂氧化總增幅低于荷斯坦牛乳硬質干酪,且在6 個月時兩種硬質干酪的氧化指標差異均不顯著,這是由于在干酪成熟后期,這些抗氧化因子發(fā)揮了極其重要的作用。在整個成熟過程中高乳脂含量的牦牛乳硬質干酪并未呈現出較荷斯坦牛乳干酪氧化程度高的規(guī)律,這為后期的研究和牦牛乳硬質干酪貯藏品質的調控提供了參考。