植物糖原負載提高姜黃素的穩定性和生物活性

韓興曼,樊金玲,王 攀,朱文學,任國艷

（河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽 471023）

姜黃素（curcumin,CCM）具有多種生理和藥理活性,如抗氧化、抗腫瘤、抗人類免疫缺陷病毒作用、抗纖維化作用等,同時也是國內外廣泛使用的天然食用色素[1]。CCM的耐熱性好、安全性高[2],但CCM的水溶性很低（11 ng/mL、25 ℃）[3],紫外穩定性差[4],中性及堿性條件下易降解[5],跨膜轉運率低[6]。這些缺陷不僅影響CCM生物活性的充分發揮,而且極大程度上限制了其在食品、保健品等領域的應用。

植物糖原（phytoglycogen,PG）是由α-1,4和α-1,6-糖苷鍵連接的、高度支化的可溶性α-D-葡聚糖,是一種具有“外緊內松”球型結構的天然納米粒[7-8]。PG分子表面和內部存在大量的葡萄糖殘基,可參與形成氫鍵,因此PG易溶于冷水或與其他物質相互作用。PG球型納米粒的分子分散密度沿半徑方向呈梯度變化,即由外至內的分子分散密度由大到小,這使得PG分子內部形成相對疏水的環境,有利于PG與極性較小的物質發生相互作用。

本課題組采用PG負載CCM,制備PG-CCM復合物,使CCM的表觀溶解度提高了約2 700 倍；PG-CCM中CCM以無定形非晶體結構存在,氫鍵和疏水相互作用是二者結合的主要作用力[9]。基于上述成果,本實驗著重考查了PG負載后CCM的紫外穩定性以及在不同pH值條件下的穩定性；同時,采用總還原力測定等方法研究了PG-CCM的抗氧化活性,采用噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）法檢測了PG-CCM對MCF-7和A549癌細胞的抑制活性。結合PG-CCM復合物中CCM的存在狀態、PG與CCM相互作用力以及CCM的分布特征,探討了負載前后以及不同復合物樣品中CCM穩定性和生物活性變化的可能機制,PG負載對于改善CCM的穩定性和提高生物利用率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加強型甜玉米‘中甜8號’ 北京金農科種子科技有限公司。

C1386 CCM 美國Sigma公司；2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS） 上海藍季生物科技有限公司；DMEM培養基 美國HyClone公司；胎牛血清 江蘇恩莫阿賽科技有限公司；胰消化酶 合肥Biosharp科技有限公司；A549細胞 國家實驗細胞資源共享服務平臺（北京總部）；MCF-7細胞ATCC細胞庫；其他試劑均為分析純,購自天津市德恩化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；H2050高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Nano-ZS90型動態光散射激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；紫外燈（253.7 nm） 江陰市飛揚器械有限公司；E191IR恒溫培養箱 美國西蒙公司；CKX41SF倒置電子顯微鏡 日本OLYMPUS公司；SWCJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；RS-232C酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 PG提取

提取方法參照Bi Lin等[10]報道并作適當修改。取‘中甜8號’玉米樣品,經粉碎、冷水浸提后,調節pH值至4.8沉淀蛋白；離心收集上清液,4 ℃冰箱中靜置沉淀淀粉；離心收集上清液,調節pH值至7,高溫（121 ℃、20 min）處理。離心取上清液,加入3 倍體積乙醇沉淀PG,抽濾得到PG固體粉末。采用3,5-二硝基水楊酸法[11]測得PG中的還原糖質量分數為0.71%,采用考馬斯亮藍法[12]測得PG中的蛋白質量分數為0.12%。

1.3.2 PG負載CCM和負載特征分析

負載方法：分別配制質量分數1%、3%和5%的PG水溶液和4 mg/mL CCM乙醇溶液。取4.95 mL各質量分數的PG溶液,加入0.05 mL的CCM溶液,于搖床中振蕩平衡（200 r/min、30 min）；離心（10 000×g、15 min）,棄去未溶的CCM沉淀,上清液即為PG-CCM復合物溶液。將部分上述溶液凍干成粉,于4 ℃冰箱中保存、備用。復合物因PG質量分數不同,分別記為1% PG-CCM、3% PG-CCM和5% PG-CCM。

負載能力分析：取PG-CCM復合物溶液1 mL,加入4 mL無水乙醇,離心（10 000×g、15 min）。收集上清液,采用分光光度法測定并計算CCM質量,檢測波長為425 nm。按式（1）計算負載能力。

CCM分布特征分析：參照Ofokansi等[13]的方法并作適當修改。精確稱取一定量不同種類的PG-CCM復合物,分別溶于去離子水中,使CCM質量濃度為20 μg/mL。每種樣品取1 mL于離心管中,各兩支。搖床振蕩20 min（37 ℃、200 r/min）；一個樣品采用分光光度法測定樣液中CCM質量濃度,記為ρA/（μg/mL）；另一個經離心（10 000×g、15 min）后用來測定上清液中CCM質量濃度,記為ρB/（μg/mL）。按式（2）計算CCM負載于PG-CCM納米粒表面的比例。

1.3.3 PG-CCM復合物納米粒的粒徑及表面電位測定

取1.3.2節中所得的PG-CCM復合物溶液,分別用蒸餾水稀釋,使PG終質量濃度均為2 mg/mL；漩渦振蕩混勻,采用Nano-ZS90型動態光散射激光粒度儀測定平均粒徑、聚合物分散性指數（polymer dispersity index,PDI）和表面電位[8]。

1.3.4 PG-CCM復合物的穩定性分析

穩定性實驗中,以PG/CCM物理混合物和CCM作為對照,PG/CCM物理混合物制備：將一定量的PG粉末和CCM混合均勻,使二者的質量比分別與1% PG-CCM、5% PG-CCM復合物相等,即得PG/CCM物理混合物。取一定量4 mg/mL CCM乙醇溶液加入去離子水,充分振蕩,即得CCM在水中的分散液。實驗期間每間隔一定時間取出一組樣品,測定CCM質量濃度,計算保留率。

1.3.4.1 紫外穩定性測定

1）加速光解條件下的紫外穩定性：精確稱取樣品,平鋪于25 mL燒杯底面,將燒杯置于紫外燈（30 W）下25 cm處照射。各復合物和相應物理混合物樣品中CCM初始質量均為20 μg,CCM樣品取5 μL 4 mg/mL CCM乙醇溶液于燒杯中,置于通風櫥將乙醇揮干。分別在1、3、5、7、9、12 h各取一組測定CCM保留率,同時比較復合物和相應物理混合物在5 h時的紫外穩定性。2）貯藏條件下的紫外穩定性：精確稱取樣品,分別置于4 ℃避光、室溫避光和室溫不避光的環境中貯藏。PG-CCM復合物樣品中CCM初始質量均為20 μg。120 d后測定CCM保留率。

1.3.4.2 酸堿穩定性測定

1）貯藏條件下的酸堿穩定性：5% PG-CCM復合物分別溶于pH 3.0～6.6的磷酸鹽緩沖液中,置于4 ℃冰箱中。CCM初始質量濃度均為20 μg/mL。第10天和第20天各取一組樣品測定CCM保留率。2）在體外模擬胃、腸液條件下的穩定性：按照Maltais等[14]所述方法分別配制不含消化酶的模擬胃液（pH 1.2）和腸液（pH 6.9、7.2）。將5% PG-CCM復合物分別溶于模擬胃、腸液中,同時將CCM和不同質量分數的PG-CCM復合物分別溶于腸液（pH 7.2）中,CCM初始質量濃度均為20 μg/mL,37 ℃水浴。第1、2、4、6、8、10、12小時各取一組樣品測定CCM保留率。

1.3.4.3 CCM質量濃度及保留率的測定

1）CCM質量濃度的測定：標準曲線繪制：采用紫外分光光度法繪制CCM標準曲線,CCM質量濃度在0～7 μg/mL的范圍內,CCM質量濃度與吸光度呈良好的線性關系,線性回歸方程為y＝0.172 1x+0.013 7（R2＝0.999 7）。固體PG-CCM復合物和PG/CCM物理混合物樣品CCM質量濃度測定：加入1 mL去離子水使之充分溶解,加無水乙醇4 mL混勻后離心（10 000×g、15 min）,取上清液,測其在425 nm波長處的吸光度,計算CCM質量濃度。液體PG-CCM復合物樣品CCM質量濃度測定：1 mL液體樣品,加入4 mL無水乙醇,按同樣方法測定吸光度并計算CCM質量濃度。固體CCM質量濃度測定：加入5 mL 80%乙醇,測定其吸光度并計算CCM質量濃度。液體CCM質量濃度測定：1 mL液體樣品,加入4 mL無水乙醇,測定其吸光度并計算CCM質量濃度。

2）CCM保留率的測定及計算：不同時間點分別取出一組樣品,測定該時刻CCM質量濃度,按式（3）計算CCM保留率。

1.3.5 PG-CCM復合物中CCM的釋放分析

參照Xie Xiaoxia等[15]的方法并略作修改。按1.3.4.2節配制模擬胃、腸液。稱取1%、5% PG-CCM凍干粉分別加入至模擬胃、腸液中,使CCM質量濃度為20 μg/mL。取1 mL于離心管中37 ℃水浴,每隔一定時間取出一組樣品,離心（10 000×g、15 min）后,按1.3.4.3節所述方法測定上清液中CCM的質量濃度；按式（4）計算CCM在模擬胃、腸液中的釋放率。

式中：ρA為0時刻樣液中CCM的質量濃度/（μg/mL）；ρB為t時刻經離心處理后上清液中CCM的質量濃度/（μg/mL）。

1.3.6 PG-CCM復合物的抗氧化活性分析

樣品準備：分別配制CCM水分散液（按1.3.4節所述方法）、CCM乙醇溶液和PG-CCM水溶液3 組樣品,并分別以去離子水、乙醇和相應質量分數的PG溶液為對照。

1.3.6.1 總還原力測定

總還原力檢測參考Fan Jinling等[16]的方法并作適當修改：取0.5 mL樣液,CCM質量濃度為0～70 μg/mL,加入1.5 mL的質量分數1%鐵氰化鉀溶液,水浴（50 ℃、20 min）,取出冷卻后,加入質量分數10%三氯乙酸溶液2.5 mL。取混合液2.5 mL,依次加入去離子水2.5 mL和質量分數0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL,充分混勻,靜置10 min后,在700 nm波長處測定其吸光度。總還原力以樣品吸光度與相應對照吸光度的差值表示。

1.3.6.2 ABTS陽離子自由基的清除活性測定

ABTS陽離子自由基的清除活性測定參考Li Gao等[17]的方法并作適當修改：將ABTS（7 mmol/L）和高硫酸鉀（2.45 mmol/L）等體積混合均勻,室溫避光靜置14 h,生成ABTS工作液；用磷酸緩沖液（0.05 mol/L,pH 7.4）稀釋至吸光度為0.70±0.02（734 nm）。取0.2 mL樣品溶液于試管中,CCM質量濃度為0～30 μg/mL,加入3.8 mL ABTS工作液,漩渦混勻后,室溫反應30 min,于734 nm波長處檢測吸光度A樣品。CCM水分散液和CCM乙醇溶液樣品的空白對照分別為水和乙醇,PG-CCM樣品的空白對照為對應質量濃度的PG溶液,測得吸光度為A空白。ABTS陽離子自由基的清除率按式（5）計算。

1.3.7 PG-CCM復合物對癌細胞抑制作用率測定

樣品準備：將CCM分散至DMEM培養基中配制CCM懸濁液,記為CCM/H2O組；將CCM溶于二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）中配制1 mg/mL母液,用DMEM培養基稀釋得到不同質量濃度樣品（DMSO質量分數控制在1%）,記為CCM/DMSO組；將PG-CCM復合物凍干粉復溶于DMEM培養基中配制不同質量濃度PG-CCM樣品液,記為PG-CCM組；上述3 組樣品濃度以CCM計,均為0～150 μmol/L。同時,將PG溶于DMEM培養基配制與PG-CCM組相同PG質量濃度的樣品,記為PG組。

MCF-7細胞和A549細胞增殖的抑制作用：采用MTT法研究樣品對MCF-7細胞和A549細胞增殖的抑制作用。MCF-7和A549細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL雙抗的DMEM培養基培養,在37 ℃、含5% CO2氣體的恒溫培養箱中培養至細胞鋪滿瓶底面積的80%；用胰酶消化后,以1×105個/mL濃度接種至96 孔板,每孔200 μL,培養6 h。棄去舊培養基,加入200 μL新鮮培養基或樣品液,繼續培養24 h。棄去舊培養基,磷酸鹽緩沖液清洗兩次,每孔加入200 μL新鮮培養基和10 μL MTT（5 mg/mL）,繼續培養4 h。倒掉培養基中液體,吸掉泡沫,加150 μL DMSO反應10 min,酶標儀測定550 nm波長處樣品孔吸光度,加MTT的樣品孔吸光度記為A2,加等體積培養基的孔吸光度記為A1,不加MTT的孔為記A0,根據式（6）計算抑制率。PG-CCM組抑制率為扣除PG組抑制率之后的數據。

1.4 數據統計與分析

1.3.7 節實驗重復6 次,其余所有實驗重復3 次,結果以平均值±標準差表示；通過DPS軟件采用單因素方差分析法比較各組結果間的差異顯著性；用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 PG-CCM復合物納米粒的粒徑、表面電位、負載能力和負載分布

PG的平均粒徑約為71 nm,PDI小于0.2,呈電中性。以不同質量分數的PG負載CCM,得到1% PG-CCM、3% PG-CCM和5% PG-CCM 3 種復合物。3 種復合物的平均粒徑、PDI及表面電位與PG相比無顯著變化,彼此之間也無顯著差異。但是,伴隨載體PG質量分數的增大,負載能力及負載于納米粒表面的CCM比例均顯著下降,當PG質量分數由1%提高到5%時,負載能力由1.887 μg/mg下降為原來的32%,而納米粒表面的負載比例則由37.5%減小到17.3%（表1）。

PG是一種天然存在的納米粒[18],具有“外緊內松”的球型結構,即由內至外,分子分散密度由小至大,這使得其分子內部形成相對疏水的環境[7]。將CCM分散于PG的水溶液時,CCM由極性較大的微環境向PG的疏水區域轉移[9],優先分布在PG的疏水內核中。載體PG質量分數較大,意味著提供了較多的內核空間,分布在內核的CCM比例高于PG質量分數較小載體。

上述研究結果表明,PG-CCM復合物是一種粒徑分布均勻、呈電中性的納米粒,CCM在納米粒中的分布因載體質量分數而異。CCM在球形納米粒載體PG中的分布特征會影響其穩定性、釋放特性及生物活性。

表1 PG-CCM復合物的粒徑、表面電位、負載能力和負載分布Table 1 Average particle size, surface potential, loading capacity and loading distribution of PG-CCM complex

2.2 PG-CCM復合物的穩定性

2.2.1 PG-CCM復合物的紫外穩定性

CCM光敏性很強,主要降解產物為香草醛、香草酸和阿魏酸[19]等。Li等[1]報道了CCM暴露于紫外燈光下12 h后的損失率為50%。紫外線照射是一種最常見、有效且簡單的滅菌方法；而貯藏過程中自然光條件下樣品的穩定性則直接影響其貨架期。紫外穩定性是CCM應用于食品等領域時需考慮的問題之一。

2.2.1.1 加速光解條件下的紫外穩定性

圖1 紫外光照射條件下PG-CCM復合物中CCM的穩定性Fig.1 Stability of encapsulated CCM in PG-CCM complex under UV irradiation

如圖1所示,CCM表現出顯著的光解不穩定性；與CCM相比,3 種PG-CCM復合物中CCM的降解速率均顯著降低,保留率依次為：5% PG-CCM＞3% PG-CCM＞1% PG-CCM。為了探究復合物對CCM保護作用可能機制,實驗進一步比較了PG-CCM復合物和相應物理混合物（PG/CCM）的紫外穩定性,從表2可看出,PG/CCM物理混合物中CCM保留率均顯著高于相應的PG-CCM復合物。5 h時,CCM的保留率為24.90%,5% PG-CCM、1% PG-CCM復合物中CCM的保留率分別提高至79.42%和59.39%,而兩種PG/CCM物理混合物CCM幾乎不損失。

表2 紫外光照射條件下PG-CCM復合物、PG/CCM物理混合物中CCM穩定性的比較Table 2 Comparison of CCM stability in PG-CCM and PG/CCM physical mixtures under UV irradiation

2.2.1.2 貯藏期間的紫外穩定性

貯藏溫度和避光處理對不同PG-CCM復合物樣品中CCM保留率的影響見表3。貯藏溫度對所有PG-CCM復合物中CCM的保留率均無顯著影響,但避光處理顯著提高了所有PG-CCM復合物中CCM的保留率。在避光條件下,不同PG-CCM復合物的穩定性均較高,彼此無顯著差異；在不避光條件下,不同PG-CCM復合物的穩定性差異顯著,其保留率依次為5% PG-CCM（65.53%）＞3% PG-CCM（48.79%）＞1% PG-CCM（29.28%）,與加速光解條件下的紫外穩定性研究結果相吻合。

表3 PG-CCM復合物在不同貯藏條件下的保留率（120 d）Table 3 Retention rates of PG-CCM complex under different storage conditions (after 120 d)%

CCM被負載或包埋后,其紫外穩定性的變化屢有報道,但結果不一,其原因也未得到很好的解釋。Li Jinglei等[2]用將CCM分散在Eudragit EPO聚合物中,制備得到Cur@EPO,CCM的紫外穩定性得到顯著提高。Onoue等[20]利用乙酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素制備了非晶固體分散體（ASD-Cur）,其紫外穩定性顯著下降。通常情況下,晶體狀態下物質的穩定性優于無定形狀態[20]。另一方面,CCM酚羥基氧原子的未成鍵電子,如果作為電子供體提供給自身分子的苯環,則CCM分子較穩定；相反,如果參與分子間氫鍵形成,CCM分子的穩定性就會被破壞[21]。本課題組前期研究表明：PG-CCM復合物中,CCM與PG通過分子間氫鍵相互作用,且由晶體狀態轉變為無定形狀態[9]。本研究中,CCM的紫外穩定性可因載體PG的物理覆蓋效應得到顯著提高。但是,由于復合物中CCM的無定形狀態以及CCM與PG之間的氫鍵作用,使得PG對CCM的保護作用在一定程度上被削弱。

不同PG-CCM復合物的紫外穩定性存在較大差異,這可能與CCM在載體PG中的分布不同有關。如上所述,載體質量分數越大,CCM分布于載體表面的比例越小,更多的CCM分布在納米粒的內核中,從而提高了對CCM的保護作用。因此,本研究中5% PG-CCM的紫外穩定性優于1%～3% PG-CCM。

2.2.2 PG-CCM復合物的酸堿穩定性

CCM在pH 6.8及以上條件快速降解[5,22],Wang等[5]報道了當CCM在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液和無血清培養基（pH值均為7.2）中37 ℃孵育30 min時,降解率約90%。CCM在食品加工過程以及在經人體胃、腸道消化時,均可能經歷較寬范圍內的pH值變化。本實驗采用體外模型考察了不同種類PG-CCM復合物在模擬胃、腸液條件下的穩定性,同時研究了5% PG-CCM復合物在不同pH值環境條件下的貯藏穩定性。

2.2.2.1 PG-CCM復合物在體外模擬胃、腸液條件下的穩定性

圖2 PG-CCM復合物在體外模擬胃、腸液條件下的穩定性Fig.2 Stability of PG-CCM complex in SGF and SIF

如圖2A所示,體外模擬胃液（pH 1.2）條件下,5% PG-CCM復合物中的CCM具有良好的穩定性,12 h的保留率高達97%；在模擬腸液條件下（pH 6.9和pH 7.2）,CCM的降解速率明顯提高,在pH 7.2模擬腸液中尤為明顯；2 h和12 h時分別損失了18%和47%。在此基礎上,進一步考查了不同質量分數PG-CCM復合物中CCM在pH 7.2模擬腸液條件下的穩定性,并與分散于模擬腸液中CCM的穩定性相比較,結果見圖2B。在模擬腸液條件下,3 種PG-CCM復合物中CCM的降解模式與CCM存在明顯差異,CCM在2 h內迅速降解,損失率約42%,之后幾乎不再降解。3 種PG-CCM復合物均在監測的12 h內發生持續降解,前期降解速率及最終降解程度由低到高依次為5% PG-CCM＜3% PG-CCM＜1% PGCCM；其中,5% PG-CCM降解速率在整個實驗期間均低于CCM,明顯提高了CCM的酸堿穩定性。

PG-CCM和CCM在腸液條件下表現出不同的降解趨勢,這一現象可能是CCM的存在狀態不同造成的。在CCM的固體分散液（20 μg/mL）中,由于CCM水中的溶解度遠低于1 μg/mL[4,23]；因此,CCM除以極少量游離態分子存在外,大部分分子因相互作用彼此聚集,形成納米粒或生成結晶沉淀[2,24-25]。不同存在狀態的CCM分子穩定性有極大差異,Li Bin等[22]報道了結晶態CCM分子的降解速率遠低于溶液中游離的CCM分子。本實驗中,在最初的2 h內,溶解狀態的游離分子或聚集較少分子納米粒中的CCM分子發生快速降解；隨后體系中的CCM主要以結晶或沉淀形式存在,不容易發生降解。因此,CCM總體降解規律表現為前期快速降解,后期維持穩定。在PG-CCM體系中,CCM由于與PG相互作用,主要以分子狀態存在,不發生結晶或沉淀；因此,其降解規律表現為降解速率持續下降。5% PG-CCM降解速率在12 h監測時間內均低于CCM,而3% PG-CCM在監測前4 h內降解速率也低于CCM,對CCM起到較好的保護作用,有利于CCM在腸道的吸收。

2.2.2.2 5% PG-CCM復合物貯藏期間的酸堿穩定性

圖3 5%PG-CCM復合物在不同pH值條件下的貯藏穩定性Fig.3 Stability of 5% PG-CCM complex under different pH conditions during storage

由圖3可知,隨貯藏時間延長,不同pH值條件下5% PG-CCM復合物中CCM的保留率均呈顯著下降趨勢；20 d時,pH 3.0～5.0之間,CCM保留率差異不明顯,約為52%～55%；而pH 6.0和pH 6.6時的保留率明顯降低,僅分別為34.91%和16.30%。表明PG-CCM適宜保存在較低pH值的環境中。

2.3 PG-CCM復合物中CCM在胃、腸液環境下的釋放率

圖4 PG-CCM復合物在體外模擬胃、腸液中的釋放Fig.4 Kinetic release profiles of encapsulated CCM from PG-CCM complex in SGF and SIF

1% PG-CCM、5% PG-CCM在體外模擬胃、腸液環境中的釋放動力學結果如圖4所示,兩種復合物中CCM的釋放特征明顯不同：1% PG-CCM復合物中CCM在胃、腸液環境下的釋放均表現出“前期突釋（0～20 min）、隨后持續釋放（20 min以后）”的兩相特征,且在胃液中的釋放率明顯高于腸液。20 min時,在胃、腸液的釋放率分別達到36.8%和17.8%,而后釋放率逐漸增長,至135 min時分別為55.1%和33.9%。5% PG-CCM復合物中CCM在胃、腸液中的釋放也存在“前期突釋”（0～20 min）現象,但隨后釋放率在整個實驗期間不再增長,保持在15%～20%左右。兩種復合物相比,1% PG-CCM復合物中CCM在胃液和腸液中的釋放率均顯著高于5% PG-CCM。

“突釋”部分的CCM通常被認為負載在載體表面,隨后持續釋放的CCM則代表結合在載體內核中[13,26]。1% PG-CCM復合物中負載于納米粒表面的比例遠高于5% PG-CCM,因此“突釋量”更高；隨后釋放的CCM可認為是從納米粒內核逐漸向表面轉移并釋放到介質中。氫鍵是PG和CCM相互作用的主要作用力之一[9],而pH值影響分子間的氫鍵作用[2,4,27]；因此,本研究中模擬胃、腸液pH值的差異是影響PG-CCM中CCM釋放量不同的主要原因。Gangurde等[4]報道了與本研究相類似的CCM釋放現象。

2.4 PG-CCM復合物的生物活性

2.4.1 抗氧化活性

分散于水中的CCM總還原力較小,且對ABTS陽離子自由基幾乎無清除活性。溶于乙醇的CCM總還原力提高,且表現出較強的ABTS陽離子自由基清除活性。3 種PG-CCM復合物的總還原力和ABTS陽離子自由基清除活性均高于CCM（無論是分散在水中或溶解于乙醇中）。不同的PG-CCM復合物相比,總還原力和ABTS陽離子自由基清除活性差異均明顯,但規律相反：總還原力為1% PG-CCM＞3%PG-CCM＞5%PG-CCM（圖5A）,而對ABTS陽離子自由基清除能力依次為5% PG-CCM＞3% PG-CCM＞1% PG-CCM（圖5B）。

CCM分子結構中的酚羥基和共軛雙鍵使其具有很強的抗氧化活性。但是,CCM的水溶性低,其在水基質中的抗氧化活性較差,在有機溶劑中的抗氧化活性往往高于分散于水的情況[28-29]。本實驗的研究結果也證實了這一點。本研究同時表明經PG負載后,CCM的抗氧化活性得到進一步提高。這可能與下面兩個因素有關：1）PG-CCM在水中具有良好的分散性；2）PG的納米粒結構提供了極大的外表面積。以上兩方面因素均有利于在水相發生的反應。類似的現象已見文獻[28-30]報道,如Chang Chao等[28]報道了果膠包被的酪蛋白酸鈉/玉米醇溶蛋白復合物負載的CCM對ABTS陽離子自由基的清活性顯著高于溶于乙醇或分散于水中的CCM。

值得注意的是,不同的PG-CCM復合物對ABTS陽離子自由基的清除活性表現出的規律與穩定性相吻合,即載體質量分數越高,CCM的活性越強。但是,總還原力表現出的規律則正好相反。還原力測定中所用的氧化劑鐵氰化物無法透過疏水區域,因此廣泛用于測定暴露在水介質中的還原性基團[30-31]。本研究中,載體PG質量分數越大,CCM分布在PG疏水內核中的比例越高,分布于表面的CCM越少。鐵氰化物無法透過PG表面進入到疏水的內核中與之反應,因此表現出較低的還原力。

圖5 PG-CCM復合物的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of PG-CCM complex

2.4.2 對癌細胞抑制作用

CCM具有抑制結腸癌細胞、口腔鱗癌細胞、肺癌細胞、人胰腺癌、腎癌細胞[32]等多種癌細胞增殖的作用。本實驗研究比較了CCM/H2O組、CCM/DMSO組和1% PG-CCM、5% PG-CCM組對A549 和MCF-7細胞增殖的抑制作用,結果如圖6所示。

圖6 PG和CCM對A549和MCF-7細胞的抑制作用Fig.6 Cytotoxicity of PG on A549 and MCF-7 and cytotoxicity of PGCCM on A549 and MCF-7

PG對兩種細胞的抑制率均小于15%,表明其對癌細胞生長的影響可忽略不計（圖6A）。如圖6B、C所示,CCM/H2O對上述兩種癌細胞的抑制作用較小,并且僅在很低的濃度范圍呈現劑量依賴關系；當濃度超過某一值后（A549為40 μmol/L,MCF-7為20 μmol/L）,抑制率不再發生明顯變化,維持在較低水平。CCM/DMSO組對兩種細胞均表現出很強的抑制作用,且具有良好的劑量依賴性；其中,對MCF-7的抑制作用更顯著。兩種PG-CCM復合物對癌細胞的抑制率在多數濃度條件下都明顯高于CCM/H2O。1% PG-CCM對兩種癌細胞的抑制作用均優于5% PG-CCM,其中對A549的抑制作用在濃度大于60 μmol/L時,與CCM/DMSO無明顯差異。

如上所述,CCM水溶性低,達到飽和濃度后,繼續增大CCM在水中的量,溶解于水中的CCM分子數量并不會因此增加,故對癌細胞的抑制作用也就不再增強。DMSO和PG負載對CCM均起到增加溶解度的作用,可以提供更多的游離CCM分子與癌細胞接觸,因此提高了對癌細胞的抑制作用。與5% PG-CCM復合物相比,更大比例的CCM分布于1% PG-CCM復合物納米粒的表層；一方面有利于與癌細胞直接接觸,另一方面有利于釋放,因此對癌細胞的抑制作用也更突出。

3 結 論

CCM負載于PG后的紫外穩定性、抗氧化活性及癌細胞抑制活性均顯著增強。PG-CCM制備時使用的PG濃度極大影響CCM的負載特征、釋放曲線、CCM的穩定性以及生物活性。5% PG-CCM復合物的紫外穩定性和酸堿穩定性均顯著優于1% PG-CCM,其中5% PG-CCM與CCM相比,顯著提高了CCM的酸堿穩定性。1% PG-CCM在胃液和腸液中的釋放率和對兩種癌細胞的抑制作用均高于5% PG-CCM。兩種復合物穩定性、釋放特性及生物活性的差異與CCM在PG中的分布狀態有關。