超聲作用下虎乳靈芝多糖-硒納米粒子的非酶糖基化抑制作用

肖益東,蔡文斐,鄭趙敏,馬會雨,黃琪琳,2,

（1.華中農業大學食品科學技術學院,湖北 武漢 430070；2.環境食品學教育部重點實驗室,湖北 武漢 430070）

目前糖尿病已成為一個全球性的嚴重公共衛生問題,中國糖尿病流行形勢尤為嚴峻。中國糖尿病不僅患者數量巨大,且患病率也高于全球水平,2017年中國糖尿病患病率高達10.9%[1],并呈現明顯上升趨勢,因此開發有關預防和治療高血糖的產品很有必要。糖尿病的主要特征是高血糖癥,葡萄糖（glucose,Glu）可以通過非酶方法糖化與血漿蛋白生成相應的共價加合物,蛋白質糖化和晚期糖基化終產物（advanced glycation end products,AGEs）的形成在糖尿病及其并發癥的發生中起著關鍵的作用[2]。AGEs是由還原糖羰基與蛋白質的自由氨基之間的非酶反應或褐變反應生成的不可逆的復雜化合物,也稱為Maillard反應產物[3]。目前AGEs抑制劑可用于治療糖尿病及其并發癥,因此越來越多關于有效抗糖化劑的研究正在進行,以用于治療AGEs導致的相關疾病。

AGEs的形成可以由Glu自氧化以及脂質過氧化引起[4],即與抗氧化之間存在一定關系,表明抗糖化劑和抗氧化劑也存在一定的關系。硒（Se）參與許多硒依賴的抗氧化酶的結構和功能,參與細胞免受氧化應激的保護,是生物學中至關重要的元素。硒是谷胱甘肽過氧化物酶等多種酶在細胞中的活性位點,對清除細胞內自由基有直接或間接作用[5-6]。此外,硒和硒蛋白復合物在抑制自由基和活性氧的傳播方面具有潛在的抗氧化作用。虎乳靈芝菌核提取物主要是一種構型為β-(1→3)-D-葡聚糖的大分子多糖[7],虎乳靈芝多糖（Lignosus rhinocerotispolysaccharides,LRP）具有獨特的多分支結構,由于超聲處理產生的空化效應[8-9],其結構會隨之發生某種程度上的變化,從而影響其生物活性。研究發現LRP具有抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化等活性,同時還能促進免疫細胞的增殖[10-12]。

多糖具有抗腫瘤、抗氧化和增強免疫調節的功效,同時硒能有效清除生物體內的自由基,具有較好的保健作用；本實驗以LRP為模板,對其進行硒化改性,在超聲處理下合成虎乳靈芝多糖-硒納米粒子（ultrasound treated LRP-selenium nanoparticles,U-LRP-SeNPs）,探究SeNPs對非酶糖基化反應的抑制作用,從而為LRP-SeNPs的進一步開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LRP為采用0.5 mol/L NaOH溶液從虎乳靈芝菌核中提取得到的堿溶性多糖[13]；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、氯化硝基四氮唑蘭（nitroblue tetrazolium,NBT）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）、氨基胍（aminoguanidine,AG）、溴酚藍、Glu 國藥集團化學試劑公司；其他試劑均為分析純。實驗用水均為2 次去離子水。

1.2 儀器與設備

JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；FP-6500型熒光光譜儀 日本Jasco公司；DYY-10C型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 LRP-SeNPs的制備

按照Cai Wenfei等[14]研究方法,配制3 份1 mg/mL的LRP溶液70 mL,分別依次加入0、1.167、1.750 mL的Na2SeO3溶液（4 mg/mL）,30 min后依次逐滴加入與Na2SeO3同等體積的抗壞血酸溶液（18 mg/mL）,室溫避光攪拌反應24 h。反應后的混合溶液經自來水和蒸餾水分別透析3 d,冷凍干燥后所得樣品按照Se/LRP質量比分別標記為Na2SeO3/LRP＝1∶15、1∶10。然后取25 mg不同比例的LRP-SeNPs樣品復溶于10 mL去離子水中,使用超聲波細胞粉碎機以20 kHz、300 W功率進行超聲處理10 min。所得樣品按照Se/LRP質量比分別標記為U-LRP-SeNPs＝1∶15、U-LRP-SeNPs＝1∶10。

1.3.2 非酶糖基化體系構建

參考Zhang Liangshuan等[15]研究方法,無菌條件下向培養瓶中加入4 mL 40 mg/mL BSA溶液和3 mL 2 mol/L Glu溶液,加入含0.02%疊氮鈉的200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）定容至10 mL,建立完全糖基化體系對照組Fa；如表1所示,同時設立不加樣品不含Glu的對照組Fb；加樣品不含BSA的對照組Fc；配制3 mg/mL的U-LRP、U-LRP-SeNPs溶液,設置終質量濃度分別為0.6 mg/mL的抑制組F,以AG為陽性對照。在25 ℃恒溫培養箱中培養15 d,分別于0、3、6、9、12、15 d進行如下實驗。

表1 非酶糖基化體系構成Table 1 Composition of glucose-BSA non-enzymatic glycosylation systems

1.3.3 NBT還原能力的測定

取0.25 mL糖基化產物和1.0 mL 0.3 mmol/L NBT（NBT溶于100 mmol/L pH 10.35碳酸鈉緩沖溶液中）,兩者在室溫下混合孵化1 h。在530 nm波長處用紫外-可見分光光度計測定吸光度[16],用碳酸鈉緩沖溶液代替糖基化物質作為空白。

1.3.4 二羰基化合物含量的測定

取0.2 mL糖基化產物,0.1 mL 500 mmol/L吉拉德-T儲備液和1.7 mL 500 mmol/L pH 2.9甲酸鈉溶液在室溫下混合孵化1 h。在294 nm波長處測定吸光度[17],以甲酸鈉溶液代替糖基化物質作為空白。

1.3.5 非酶糖基化抑制率的測定

取0.75 mL糖基化產物,測定糖基化終產物在激發波長370 nm、發射波長440 nm處的熒光強度F[18],按式（1）計算樣品對非酶糖基化的抑制率。

式中：F為樣品+BSA+Glu的熒光強度；Fa為BSA+Glu的熒光強度；Fb為只含BSA的熒光強度；Fc為只含樣品的熒光強度。

1.3.6 糖基化蛋白生成率的測定

在25 ℃培養15 d后,取出孵化后蛋白；按照Ma Jun等[19]的研究方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）實驗；經考馬斯亮藍染色脫色后,用凝膠成像系統拍照,Image Lab 3.0軟件分析原BSA和糖基化BSA的光密度值,按式（2）計算糖基化蛋白的生成率。

1.4 數據處理

實驗進行3 組平行,3 次重復,所有數據以Origin Pro 2015軟件進行處理,結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 非酶糖基化體系條件的確定

Glu通過非酶方法糖化與血漿蛋白反應形成共價加合物,最終生成的AGEs在糖尿病及其并發癥的發生中起著關鍵作用。非酶糖基化和氧化反應之間具有密切聯系,氧化反應參與非酶糖基化反應,糖基化反應同時又促進氧化反應[20]。AGEs主要通過破壞與其交聯的蛋白質,促進機體的氧化應激反應。在非酶糖基化的第一階段,還原糖與游離氨基反應生成席夫堿,進一步反應生成穩定的酮胺,即Amadori產物；Amadori產物在堿性溶液還原NBT,在530 nm波長處產生最大吸收波長,因此可用果糖胺比色法測定蛋白質初期糖化的程度。在第二階段,通過氧化脫水,Amadori產物隨后降解成多種α-二羰基化合物,這些化合物反應能力更強。在第三階段,α-二羰基化合物再次與游離氨基反應,通過氧化、脫水和環合反應,形成具有熒光的、不可逆的終產物,通常稱為AGEs[21-22]。AGEs會引起不同類型的蛋白質修飾,導致機體結構和功能的損害。因此,本實驗在25 ℃恒溫培養箱中構建非酶糖基化體系,使用AG作為陽性對照,反應15 d來評價U-LRP-SeNPs對AGEs形成的抑制作用。

2.2 NBT還原實驗結果

研究可知U-LRP-SeNPs具備較好的穩定性,U-LRP-SeNPs溶液能夠保持均相體系（均勻分散、不會發生明顯的相分離和分層現象）16 d,沒有任何明顯的沉淀產生,粒徑略有增加但基本都保持在200 nm內[14]。而非酶糖基化體系反應時間較長,為保證實驗結果的準確性,本實驗研究超聲處理后的U-LRP-SeNPs體系對非酶糖基化的抑制作用,其中BSA+Glu為完全糖基化組,AG+BSA+Glu為陽性對照組,U-LRP-SeNPs+BSA+Glu為抑制組。

在蛋白質非酶糖基化反應發生的早期階段,還原糖與存在于蛋白質中的自由氨基反應生成席夫堿,然后產生穩定的酮胺,也稱為Amadori產物[22-23]。Amadori產物可以還原NBT,然后在530 nm波長處產生最大吸收峰的有色反應物[24],因此可以通過NBT還原實驗來研究非酶糖基化反應初期的情況。

圖1 NBT還原能力隨反應時間的變化Fig.1 Determination of NBT reducing power as affected by U-LRP and U-LRP-SeNPs

圖1為不同Se/LRP質量比的U-LRP-SeNPs對NBT還原實驗的產物抑制效果。可以發現,終質量濃度為0.6 mg/mL時,U-LRP和U-LRP-SeNPs對Amadori產物的形成具有一定的抑制活性,但抑制效果較差,存在時間的依賴性。在反應初期（0～4 d）,Amadori產物增加最為迅速,其后增長速率有所下降。在15 d的培養時間內,U-LRP-SeNPs＝1∶15對Amadori產物的抑制作用相對較好,抑制NBT還原能力依次為U-LRP-SeNPs＝1∶15＞U-LRP-SeNPs＝1∶10。整體結果表明,U-LRP-SeNPs對糖基化反應初期的抑制作用不明顯。這主要是因為LRP自身含有部分還原糖,反應初期糖類參與自由氨基反應,因此抑制效果不明顯。

2.3 二羰基化合物的含量變化

在中間反應階段,氧化和脫水后,Amadori產物隨后降解產生具有高反應性的二羰基化合物。研究表明,二羰基化合物可以誘導蛋白質的快速交聯并產生穩定的AGEs[25],大約45%～50%的AGEs來源于二羰基化合物[26]。如圖2所示,二羰基化合物的含量在反應初期增長速率較慢,存在一定的時間依賴性,隨著時間的延長而逐漸增加。與完全糖基化組相比,加入U-LRP和U-LRP-SeNPs可以明顯降低二羰基化合物的含量,表明終質量濃度為0.6 mg/mL的U-LRP和U-LRP-SeNPs對二羰基化合物的生成有較好的抑制效果。在第15天時,U-LRP-SeNPs＝1∶15和U-LRP-SeNPs＝1∶10表現出較好的抑制能力,抑制率分別為50%和46%,且U-LRP-SeNPs抑制效果明顯強于U-LRP,這與SeNPs的存在有一定關系。研究表明硒可以阻斷自由基鏈反應[27],其次,具有較大比表面積的SeNPs可以提供許多與自由基結合的相關位點,屏蔽或終止了自由基反應,從而有效抑制自由基引發的氧化反應。通常,SeNPs的比表面積與SeNPs尺寸密切相關,其中,粒徑越小,比表面積相應越大[14]。此外,SeNPs的穩定性對清除自由基有積極作用[14],因為SeNPs的穩定性較差會導致更多的SeNPs聚集,活性表面減少,與自由基結合的位點減少,從而導致游離的高能態自由基增多,繼而引發氧化反應,而超聲處理有效提高了U-LRP-SeNPs的分散穩定性,使SeNPs與自由基結合的位點增多,從而屏蔽甚至清除自由基。

圖2 二羰基化合物含量隨反應時間的變化Fig.2 Determination of dicarbonyl compounds as affected by U-LRP and U-LRP-SeNPs

2.4 終產物熒光強度分析結果

在反應末期,α-二羰基化合物再次與自由基反應,通過氧化、脫水和環化等一系列相關反應,形成產生熒光的終產物[22]。如圖3所示,到反應末期時,與完全糖基化組相比,加入終質量濃度為0.6 mg/mL的U-LRP-SeNPs可以有效降低熒光強度；其中陽性對照AG組熒光強度明顯降低,表明U-LRP-SeNPs和AG能有效抑制AGEs的形成,其中U-LRP-SeNPs＝1∶10和U-LRP-SeNPs＝1∶15整體的抑制效果較好,處于相對穩定的狀態。表2所示為U-LRP和U-LRP-SeNPs對糖基化過程中AGEs的具體抑制率變化。其中U-LRP-SeNPs組對糖基化具有較好的抑制作用,從第8天開始,U-LRP-SeNPs＝1∶15抑制率基本保持在20%左右；U-LRP-SeNPs＝1∶10抑制率隨著時間的延長略有下降但基本保持在30%,前期抑制效果較好,高達37%,后期因抑制劑部分消耗因此有所下降。此外U-LRP抑制效果不理想,直到反應末期才達到10%左右。研究發現,某些物質抗糖基化活性與抗氧化活性密切相關[28],氧化反應和非酶糖基化反應兩者相互作用,參與并促進對方體系的反應。氧化應激能激活蛋白激酶C,促進細胞外基質的代謝和相關因子的表達,造成糖尿病及其并發癥的發生。AGEs主要通過破壞與其交聯的蛋白質,促進機體的氧化應激反應[20]。在之前的抗氧化研究中,U-LRP-SeNPs被證實是具有較好的抗氧化的能力[14],SeNPs的存在是增強體系抗氧化活性的關鍵因素。而本實驗中U-LRP-SeNPs對AGEs的抑制作用明顯強于U-LRP,證實了氧化反應和非酶糖基化反應兩者之間存在一定關系,同時也說明SeNPs是抑制兩者反應發生的重要因素。

圖3 終產物熒光強度隨反應時間的變化Fig.3 Determination of fluorescence intensity of AGEs as affected by U-LRP and U-LRP-SeNPs

表2 終產物抑制率Table 2 Inhibitory ratios of U-LRP-SeNPs on the formation of AGEs

2.5 糖基化蛋白條帶圖譜及生成率的分析結果

由圖4a可知,在分子質量97 kDa處,可見明顯的糖基化蛋白條帶,表明在AGEs形成期間發生蛋白質與多糖之間的交聯結合；加入不同抑制劑以后,可以發現97 kDa處條帶的灰度發生不同程度的變化,表明抑制劑U-LRP-SeNPs起到了一定的抑制作用。使用圖像分析軟件Image Lab 3.0計算每個條帶的強度,糖基化BSA與原始BSA的強度比顯示在圖4b中。U-LRP-SeNPs抑制了糖基化BSA條帶的形成,抑制作用U-LRP-SeNPs＝1∶15大于U-LRP-SeNPs＝1∶10,由條帶分析可知抑制率分別為45.8%和40.2%,SDS-PAGE與終產物熒光強度實驗結果趨勢一致。SDS-PAGE結果表明,U-LRP沒有表現出明顯的抑制效果；作為抑制劑,U-LRP抗糖基化主要抑制糖基化反應的第二階段,而在糖基化過程的第一、三階段抑制效果不明顯。AGEs的特征是氧化反應參與了熒光分子交聯的形成,Amadori重排產物的形成涉及的是非氧化反應。而U-LRP抗氧化活性較差[14],因此,其非酶糖基化抑制作用也較差[22,29]。綜上所述,兩種不同比例的U-LRP-SeNPs能夠抑制AGEs的形成,可以有效預防由高血糖引起的機體損害,這為其在治療糖尿病及其并發癥和相關功能食品開發方面提供了良好的應用前景和一定的理論依據。

圖4 SDS-PAGE糖基化蛋白條帶圖譜及分析Fig.4 SDS-PAGE profile of glycosylat protein bands and analysis

2.6 超聲作用下SeNPs對AGEs作用機制

圖5 超聲作用下SeNPs抑制AGEs產生的機制Fig.5 Mechanism of the inhibitory effect of ultrasound treated SeNPs on the generation of AGEs

由先前研究可知,由于超聲空化效應,支化LRP的纏結鏈被部分解開,其致密的線團結構變得松散,使得SeNPs容易擴散到LRP內部分支并穩定于分支鏈中,其中U-LRP-SeNPs＝1∶10、1∶15時具有最佳的穩定性和較小的粒徑[14]。硒可以中斷自由基鏈反應,小尺寸的SeNPs具有大的比表面積以提供大量的結合位點來屏蔽或終止自由基,從而抑制自由基引發的氧化反應。超聲空化效應可以破壞聚集物,使SeNPs能夠以盡可能小的尺寸分散并穩定在LRP基質中,這些具有較大比表面積的SeNPs可以提供許多與自由基結合的相關位點,屏蔽或終止自由基,最終抑制自由基引發的氧化反應。由圖5糖基化反應過程可以發現,糖基化反應第二、三階段主要涉及自由基的氧化,第一階段屬于非氧化反應。因此,在第一階段,即使有SeNPs的存在,其抑制作用也并不明顯；當席夫堿環化、異構化重排生成Amadori產物并進一步氧化生成二羰基化合物以及最終生成晚期糖基化產物時,SeNPs存在使得反應進程受到抑制,且U-LRP-SeNPs具有更好的穩定性和比表面積,這使得SeNPs更加充分地參與并抑制自由基引發的非酶糖基化反應的中后期氧化反應,將非酶糖基化反應阻止于氧化階段,從而大大提高了非酶糖基化反應的抑制效果。而LRP在整個過程中并沒有良好的抑制效果,表明SeNPs對非酶糖基化抑制作用的重要性,也從側面反映出糖基化抑制作用與抗氧化活性密切相關。

3 結 論

非酶糖基化和氧化反應之間具有密切聯系,氧化反應是非酶糖基化反應的中后階段,糖基化反應同時又促進氧化反應。超聲處理后具有較好抗氧化活性的U-LRP-SeNPs能有效抑制非酶糖基化反應,且存在一定的劑量依賴效應；其中U-LRP-SeNPs＝1∶10、1∶15具有較好的非酶糖基化抑制活性,抑制率分別達到30%和20%。超聲處理有效提高了U-LRP-SeNPs穩定性,SeNPs的穩定性對清除自由基有積極作用；具有較大比表面積的SeNPs可以提供許多與自由基結合的位點,屏蔽或終止自由基,有效抑制了自由基引發的氧化反應,最終提高非酶糖基化抑制效果。