鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌患病小鼠腸道菌群的影響

武瑞赟,馬儷珍,李平蘭,

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083；2.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384）

在人和動物腸道內寄居有大量細菌、病毒等復雜的微生物群體[1],宿主腸道和這些微生物建立起密不可分的共生關系,宿主腸道為微生物群體提供營養和生存場所[2-3],同時這些微生物也對宿主的營養、代謝和免疫功能調節發揮重要作用[4-5]。因此,它們之間的相互作用研究成為逐漸興起的熱點。伴隨著美國“人類微生物組計劃”和歐盟“MetaHit計劃”的完成,人們已對寄居在遠端腸道內的復雜微生物生態系統有了更深入的了解[6],近年來,越來越多的證據表明,腸道微生物的關鍵生理作用與機體之間有著密切關系[7-9],特別是在宿主健康和疾病中發揮著重要作用[10-12],如Lee等[13]發現人體中菌群的改變與人乳頭瘤病毒的感染有關。

腸道微生物是指寄居在機體消化道的數以萬億計的微生物[14-15]。它們按照一定比例組合在一起,相互依存、制約、共生,形成相對穩定的腸道微生態[16-19]。個體之間菌群數量、結構、豐度及生理狀態均存在差異[20]。在正常腸道微生物菌群中,擬桿菌門及厚壁菌門最多,約占90%[21],其他較少的門類菌群有放線菌門[22]、變形菌門[23]等。腸道菌群可寄居于不同部位,通過特定菌群結構、活動、代謝產物等共同影響機體的代謝,維持內環境穩態。但是腸道菌群與宿主之間存在密切的互利共生關系,菌群的穩定與宿主年齡、遺傳背景、飲食、生活環境等相關,反過來,宿主能影響腸道菌群的結構和功能,而腸道菌群也可通過其特有的功能屬性,影響宿主的生長代謝[24],Chaplin等[25]通過分析在高脂肪飲食下接受鈣補充的C57BL/6J小鼠中的腸道微生物群,并確定其與宿主代謝的關系。

結直腸是人體中重要的消化器官,具有消化、營養物質代謝以及貯存食物殘渣的作用。但是,由于食物殘渣以及代謝產生的一些酸類、酚類等致癌物,使得腸屏障的完整性、免疫系統等受到了侵襲和破壞,增加了結直腸癌的患病風險。結直腸癌是常見的一類以體質量減輕、嚴重腹瀉以及腹痛為典型性特征的慢性和復發性消化道疾病[26-27],一般發生在回腸、結腸和直腸處。

目前結直腸癌的詳細致病機制尚不清楚,腸道微生物[28-30]、腸上皮屏障以及腸免疫系統構成的穩態失調可能是影響結直腸癌發生的關鍵因素[31]。前期實驗發現,鱘魚硫酸軟骨素具有抑制結直腸癌腫瘤細胞增殖的作用[32]。因此,本實驗以結直腸癌小鼠為模型,通過對小鼠腸道內容物的細菌菌群多樣性進行分析,探究鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌患病小鼠腸道菌群的影響,研究結果為開發以鱘魚軟骨素為基礎的膳食營養補充劑以預防和降低結直腸癌發生風險提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

鱘魚硫酸軟骨素由中國農業大學食品科學與營養工程學院應用微生物實驗室制備；雄性BALB/c裸鼠（生產許可證號：SCXK（京）2016-0006） 北京維通利華實驗動物技術有限公司；瓊脂糖 美國Sigma公司；DNA DL2000 Marker 北京艾德萊生物科技有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇 北京化學工業集團有限公司；糞便基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

超低溫冰箱 海爾集團公司；SCL-1300垂直流潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；GB303電子天平梅特勒-托利多（上海）集團；4200型凝膠成像系統 上海天能科技有限公司；BG-power300電泳儀 北京百晶生物科技有限公司；GL-206低速離心機 湖南平凡儀器儀表有限公司；1658001型垂直電泳槽 美國伯樂公司；HiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 動物的分組和處理

SPF級健康的5 周齡雄性BALB/c裸鼠飼養于北京市實驗動物中心,按照SPF級實驗動物的要求在屏障環境中進行飼養和管理。

飼養條件：動物房溫度為（22±2）℃,相對濕度為（50±10）%,嚴格按照12 h光照/黑暗循環,實驗鼠進行自由采食和進水。

BALB/c裸鼠適應性喂養一周后,隨機分為6 組,每組10 只,采用皮下注射結直腸癌細胞的方法建立結直腸癌模型小鼠,注射兩周后,瘤組織體積約為30 mm3,之后每天定時灌胃不同劑量的待測樣品,連續灌胃4 周。具體分組為：1）正常對照組：未注射結直腸癌細胞,灌胃生理鹽水；2）模型組：注射結直腸癌細胞,灌胃生理鹽水；3）陽性處理組：注射結直腸癌細胞,灌胃5-氟尿嘧啶；4）低劑量組：注射結直腸癌細胞,灌胃低劑量鱘魚硫酸軟骨素（100 μg/g）；5）中劑量組：注射結直腸癌細胞,灌胃中劑量鱘魚硫酸軟骨素（200 μg/g）；6）高劑量組：注射結直腸癌細胞,灌胃高劑量鱘魚硫酸軟骨素（400 μg/g）。

1.3.2 小鼠腫瘤組織體積、質量的測定

小鼠腫瘤組織體積的測定：皮下注射結直腸癌細胞HCT-116后,使用游標卡尺每4 d測量一次各組小鼠腫瘤長度、寬度,腫瘤體積（V）按下式計算。

小鼠腫瘤組織質量的測定：實驗結束后,對各組實驗鼠進行取材處理,剖取各組小鼠腫瘤組織并稱質量/g,記錄各組小鼠腫瘤組織質量。

1.3.3 糞便的采集

在實驗結束前,采用壓迫擠壓法采集各組實驗小鼠的新鮮糞便,左手抓緊并固定好小鼠,右手輕輕擠壓小鼠直腸,無菌離心管收集新鮮的糞便樣本,將采集好的樣本貯藏于-80 ℃冰箱、備用,避免反復凍融。

1.3.4 糞便中DNA的提取

取-80 ℃貯藏的糞便樣本,參照糞便DNA提取試劑盒說明書對各實驗組中小鼠的糞便進行總DNA的提取。

1.3.5 腸道菌群16S rRNA V3區PCR擴增

基于腸道菌群的16S rRNA基因V3～V4區域合成相關引物為515F（5'-ACTCCTCCGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACGCGGGTATCTAAT-3'）。擴增體系包括2×Phanta Max緩沖液12.5 μL、10 mmol dNTP Mix 0.5 μL、10 μmol引物-F 1.0 μL、10 μmol引物-R 1.0 μL、1 U/μL DNA聚合酶0.5 μL、模板DNA 20.0 ng,加水補充至25.0 μL。聚合酶鏈式反應程序為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共23 個循環；72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。擴增后進行混樣、建庫并做相應的檢測,使用設定的標簽序列進行樣本區分。檢測合格的擴增子文庫將采用Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺對樣品進行測序。

1.4 數據處理與分析

1.4.1 數據預處理和序列質量優化統計

對Illumina HiSeq 2500測序得到的原始數據,利用軟件FastQC進行數據質量評估和數據過濾,并利用Pandaseq軟件進行序列優化統計。實驗數據均是將低、中、高劑量組與正常對照組、模型組和陽性處理組進行比較分析。實驗結果以平均值±標準差表示。用SPSS 20軟件分析數據,顯著性分析采用單因素方差分析和Duncan's多重檢驗,P＜0.05表示存在顯著性差異。

1.4.2 操作分類單元聚類分析

根據97%的序列相似性水平,利用QIIME軟件包中的uclust聚類方法將移除嵌合體后的序列歸為多個操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs）,得到OTU聚類結果。然后基于SILVA參考數據庫,利用RDP Classifier軟件對每個樣品的OTUs進行分類學注釋。

1.4.3 稀釋曲線和物種相對豐度分析

對OTU的序列進行隨機抽樣,分析序列數與OTU數目的關系,構建稀釋曲線并做多樣性分析。

1.4.4 腸道微生物菌落組成分析

使用Qiime軟件,并根據OTU分類結果對各組小鼠腸道微生物組成進行分析,分別從門、科和屬等不同分類水平上了解各組腸道微生物組成和結構的變化特點。

1.4.5 組間相似性分析

主坐標分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）是一種通過分析數據距離、矩陣來研究數據間相似性或差異性的可視化方法。通過UniFrac分析得到所有樣品的距離、矩陣數據,然后進行PCoA,了解各組小鼠腸道微生物群落間的相似性。

2 結果與分析

2.1 鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌荷瘤小鼠中腫瘤組織體積與質量的影響

圖1 各組小鼠腫瘤組織體積及質量Fig.1 Tumor volume and mass

由圖1A可知,與模型組相比,低、中、高劑量組實驗小鼠的結直腸腫瘤組織體積的增長速率隨口服劑量的增加而下降,呈現劑量依賴性,與模型組的體積相比差異顯著（P＜0.05）。同時,腫瘤組織質量結果顯示（圖1B）,與模型組比較,隨灌胃鱘魚硫酸軟骨素劑量的增加,腫瘤質量顯著降低（P＜0.05）,表明對于已經形成結直腸癌的小鼠,口服鱘魚硫酸軟骨素可以減緩腫瘤的生長發展,起到治療的作用。

2.2 物種相對豐度結果分析

2.2.1 稀釋曲線分析

稀釋性曲線是指采用隨機抽樣的方法,從樣本中隨機抽取一定數量的個體,統計出這些個體所代表物種數目,并以個體數與物種數來構建的曲線,它可以用來比較不同的樣本之間的物種豐富度,還能夠直觀地反映樣本的取樣大小是否合理。稀釋曲線（圖2）結果表明,當測序量增多時,樣本中物種多樣性的增長幅度較低,說明測序量對樣本中物種多樣性的貢獻率較小,當前所選的樣本測序量足夠多,可以較好地反映樣品中的微生物物種信息。

圖2 各組樣本Shannon指數曲線Fig.2 Shannon exponential curves of the samples

2.2.2 相對豐度分布曲線分析

圖3 各組樣本相對豐度分布曲線Fig.3 Relative abundance curves of the samples

OTU是在系統發生分析或群體遺傳研究中的一個假定的分類單元。對于樣本的微生物組成研究,目前常用分類單元主要有門、綱、目、科、屬、種6 個水平。通常以閾值序列相似性為97%為同一類,每一個類就是一個OTU,代表一個種。Rank-Abundance曲線可以同時用于反映測序樣品中所含物種的豐富程度和均勻程度,其中曲線越長,說明物種組成越豐富,曲線越平滑,則表明物種組成的均勻程度越高。

豐度分布曲線（圖3）中的每條曲線分別對應一個測序樣本,橫坐標表示OTU相對豐度按等級降序排列,縱坐標表示該OTU中序列數的相對豐度,結果顯示,測序樣本的物種序列數主要分布在100～700,且組成分布均勻。

2.2.3 多樣性分析

為了更好地了解每個樣本本身的生物多樣性情況,通常會通過多個指標來表示,俗稱多樣性分析。本實驗以Chao1指數、ACE值、Shannon指數和Goods's coverage指數來反映各組樣品的物種相對豐度和群落多樣性,數值與物種的豐度呈正相關。其中,Goods's coverage指數可以反映測序深度,數值越高,樣本中沒有被檢出的概率越低。如表1所示,各組小鼠的測序深度均為0.98以上、漸近1,且無顯著性差異（P＞0.05）,表明各組樣本的序列基本均被檢出。

表1 各組小鼠腸道菌群的多樣性分析Table 1 Diversity analysis of intestinal flora in mice from each group

人和動物腸道內定植著龐大的微生物群體,這些微生物在代謝膳食營養、促進免疫系統發育、抵抗病原微生物入侵等方面發揮重要作用[33]。近年來研究發現,許多的腸道基本疾病可能與腸道微生物多樣性或者相對豐度的降低有關。結果表明,模型組樣本的Chao1指數、ACE值均低于正常對照組,說明腸炎疾病可以引起小鼠腸道菌群中物種數量的改變及降低物種數量。同時,模型組的Shannon指數顯著高于正常對照組（P＜0.05）,說明患結直腸癌可以使小鼠腸道菌群的多樣性發生改變并降低。灌胃不同劑量的鱘魚硫酸軟骨素,可以使患病模型小鼠腸道微生物的Shannon指數降低,且逐漸趨于正常組,其中高劑量組的Shannon指數低于陽性對照組。由此可見,灌胃鱘魚硫酸軟骨素能夠一定程度上增加結直腸癌患病模型小鼠腸道內的菌群多樣性,起到調節腸道微生物菌群的作用。

2.3 腸道微生物菌落組成結果分析

2.3.1 基于門水平的微生物菌落結構分析

由圖4可知,各組小鼠腸道菌群檢測中,樣品共注釋到14 個細菌門類,分別為產古菌門（Euryarchaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、糖化菌門（Saccharibacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、互養菌門（Synergistetes）、柔膜菌門（Tenericutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中,擬桿菌門和厚壁菌門為主要的優勢菌門。

圖4 各組小鼠腸道菌群在門水平上的注釋結果Fig.4 Annotation results of intestinal microflora at the phylum level in mice from each group

關于腸道疾病與腸道菌群的關系近年來受到了廣泛的關注。已有文獻和研究證明,腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的比例對腸道健康影響不大[34],但梭桿菌門是主要的腸道致病菌,與癌癥等多種疾病相關,尤其在結直腸癌中,具核梭桿菌作為共生致病菌是目前較為明確的與癌癥有密切關系的菌[35],其可以促進癌細胞的發育、生長、傳播以及影響癌癥治療的響應[36]。結果表明,模型組中的梭桿菌門相對豐度（0.008 5%）顯著高于正常對照組（0.001 3%）（P＜0.05）,經灌胃鱘魚硫酸軟骨素處理后,小鼠腸道中的梭桿菌門相對豐度降低并且趨于正常對照組,其中高劑量組中的梭桿菌門相對豐度約為0.001 4%,表明鱘魚硫酸軟骨素可以改變結直腸癌患病小鼠腸道中的梭桿菌門相對豐度,進而起到對結直腸的調節作用（圖5A）。

糖化菌門的主要作用是將多糖轉化為簡單的雙糖和單糖,利于人體的吸收[37]。結果發現,灌胃鱘魚硫酸軟骨素后,小鼠中的糖化菌門相對豐度顯著增高（P＜0.05）,明顯高于正常對照組（0.15%）、模型組（0.47%）、陽性處理組（0.33%）,且隨著灌胃劑量的增加,腸道中糖化菌門的相對豐度增加,其中低劑量組為1.65%,中劑量組為1.85%,高劑量組可達2.10%,說明鱘魚硫酸軟骨素灌胃后能夠增加糖化菌門含量,促進多糖的吸收,改變腸道菌群的結構（圖5B）。

圖5 各組小鼠腸道內糖化菌門的相對豐度Fig.5 Relative abundance of intestinal microflora in mice from each group

2.3.2 基于科水平的微生物菌落結構分析

腸道菌群的平衡和穩定有利于腸道及機體的健康,而腸道菌群的多樣性受到了生活方式以及自身的影響。為了進一步探究鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌小鼠腸道菌群的影響,本實驗在門水平基礎上,進一步分析了科水平上的變化。由表2可知,正常對照組小鼠和灌胃鱘魚硫酸軟骨素高劑量組小鼠中腸道的優勢菌均為類桿菌科（Bacteroidaceae）、擬桿菌目S27科（Bacteroidales S24-7 group）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）,與正常對照組相比,模型組中的Ruminococcaceae相對豐度由15%降至12%,同時Bacteroidales S24-7 group相對豐度由30%降至18%,且患病模型組小鼠腸道內科水平的優勢菌發生了改變,變為Bacteroidales S24-7 group 18%、Lachnospiraceae 18%以及Ruminococcaceae 12%。

近年來,擬桿菌屬對癌癥的調節作用受到了研究者的關注和證明,Vetizou等[38]研究發現,CTLA-4作為一種新的免疫抑制藥物,具有抗腫瘤作用,并且CTLA-4的抗腫瘤作用取決于不同的擬桿菌菌屬,在小鼠和患者中,Bacteroidales或脆弱擬桿菌特異性的T細胞應答與抗癌藥物對癌細胞增殖的阻斷功效相關,同時已證實,脆擬桿菌具有抗癌特性[39]。進一步研究發現,一些糖類物質能夠促進擬桿菌屬中的某些細菌的生長[40]。實驗結果也顯示出,灌胃鱘魚硫酸軟骨素后,隨灌胃劑量的增加,小鼠中Bacteroidales S24-7group相對豐度總體呈增加趨勢,其中低劑量組僅為31%,高劑量組則可達40%,說明鱘魚硫酸軟骨素可以提高Bacteroidales S24-7group的相對豐度；與模型組（18%）相比,說明鱘魚硫酸軟骨素可能通過提高擬桿菌屬的相對豐度,抑制結直腸癌的發展。灌胃鱘魚硫酸軟骨素后,小鼠腸道菌群中的科水平微生物含量逐漸趨于正常組小鼠,結合在灌胃鱘魚硫酸軟骨素素治療的過程,以及前期細胞實驗的結果[32],說明鱘魚硫酸軟骨素可以通過調節腸道菌群的平衡,改善腸道炎癥的病變。

表2 各組優勢菌科水平Table 2 Distribution of dominant bacteria in samples at the family level

2.3.3 基于屬水平的微生物菌落結構分析

選取相對豐度在前15%的菌進行屬水平的菌落組成分析,結果如圖6所示。正常組腸道內相對豐度在2%以上的屬水平菌分別為擬桿菌屬（16.47%）、BacteroidalesS24-7 group（24.56%）、阿利斯泰伯屬（8.48%）、嗜胃氣桿菌屬（2.21%）、LachnospiraceaeNK4A136group（3.39%）、RuminococcaceaeUCG-014（9.54%）、Akkermansia（8.48%）,與結直腸癌患病小鼠模型組對比發現,Ruminiclostridium5在患病小鼠的腸道內相對豐度明顯升高,由正常組的0.92%升高到2.05%。已有研究發現,Ruminiclostridium5主要與腸道、肝臟等慢性疾病相關,具有促進炎癥發生的作用[41],結果顯示,當灌胃鱘魚硫酸軟骨素后,小鼠腸道內的Ruminiclostridium5相對豐度隨著灌胃劑量的增加而降低,在高劑量組中,相對豐度為0.41%,基本接近正常組,說明鱘魚硫酸軟骨素具有一定的抗炎作用。

圖6 各組小鼠腸道菌群在屬水平上的注釋結果Fig.6 Taxonomic composition and distribution in samples at the genus level

LachnospiraceaeNK4A136 group、Oscillibacter都與機體的炎癥反應相關,二者含量的增加能夠加重機體的炎癥,增加機體患病風險。Li Jun等[42]通過使用新得到的益生元混合物灌胃模型小鼠,發現可以減緩腫瘤的生長,與正常對照組相比顯著降低腫瘤大小約40%,說明益生元改變了腸道微生物群落中有益細菌的優勢,其中包括Prevotella和Oscillibacter,它們可以產生抗炎代謝物。結果發現,患病模型組中的LachnospiraceaeNK4A136 group、Oscillibacter相對豐度增加,且明顯高于正常組；在治療組中,灌胃不同劑量的鱘魚硫酸軟骨素后,體內兩種菌在屬水平上的相對豐度都降低,其中高劑量組由模型組的LachnospiraceaeNK4A136 8.45%、Oscillibacter1.1%分別降低至3.49%和0.68%,恢復至正常組水平（3.39%和0.61%）。因此,鱘魚硫酸軟骨素可通過抑制促炎菌的生長改變腸道中菌群的數量,促進抗炎代謝產物的產生,進而增加抗炎能力,抑制癌細胞的增殖,最終起到緩解癌癥的作用。

2.4 組間相似性結果分析

PCoA將多維數據進行降維,是一種研究數據相似性或差異性的可視化方法。為了更好地比較各組之間的微生物群落結構的多樣性和各組腸道微生物組成間的相似性,本實驗采用樣品聚類的方法進行PCoA（圖7）。

PCoA中樣本點之間的距離越靠近,表明對應的樣品間的腸道微生物組成越相似。各組小鼠腸道菌群PCoA二維圖中可以看出,兩種主坐標分別貢獻了11.84%和9.66%的差異。李敏[43]通過構建急性結腸炎小鼠模型,發現在不同處理后的小鼠腸道菌群PCoA中,兩種主坐標貢獻率為17.7%和13.2%；同時,張任帥[44]通過對葡聚糖硫酸鈉誘導的腸炎小鼠模型灌胃松花多糖后發現,PCO1和PCO2是兩個主坐標成分,PCO1表示盡可能最大解釋數據變化的主坐標成分,PCO2為解釋余下的變化度中占比例最大的主坐標成分,分別為15.2%和11.93%,貢獻率相對較小,與本實驗結果相似,這可能是由于腸道微生物的構成、改變是多方面、多因素的,也可能是由于實驗處理樣本相對較少。

圖7 各組小鼠腸道菌群PCoA主成分分析Fig.7 Principal co-ordinates analysis of intestinal flora of mice from each group

但是,與正常組相比,陽性對照組各樣本間的分散程度較高,說明5-氟尿嘧啶可以能會造成腸道菌群的紊亂,與上文中門水平的注釋結果一致。正常對照組、模型組、陽性處理組和灌胃低、中、高劑量的鱘魚硫酸軟骨素各組的菌相組成存在差異。其中,灌胃鱘魚硫酸軟骨素的各組樣本之間比較分散,可能是由于樣本本身的個體存在差異,且低劑量組和中劑量組與模型組也存在著部分的相似性,而高劑量組則與模型組差異較大,結合之前鱘魚硫酸軟骨素灌胃處理后,小鼠腸道菌群在門、科以及屬水平的變化,可以說明鱘魚硫酸軟骨素可以引起小鼠腸道菌群組成的改變。

3 結 論

本實驗利用皮下注射結直腸癌細胞的方法,構建了結直腸癌患病小鼠模型,探究了灌胃鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌小鼠腸道菌群組成的影響。結果顯示,鱘魚硫酸軟骨素可以改變小鼠腸道微生物的數量和多樣性,結直腸癌患病小鼠中BacteroidalesS24-7 group、毛螺菌科以及瘤胃菌科相對豐度明顯優于其他組,為主要的優勢菌科,具有增加結直腸癌的患病風險。同時,灌胃鱘魚硫酸軟骨素后,小鼠腸道中的優勢菌屬發生改變,且部分菌屬相對豐度改變,LachnospiraceaeNK4A136 group和Oscillibacter相對豐度明顯降低,逐漸趨于正常對照組小鼠,說明鱘魚硫酸軟骨素可通過抑制促炎菌的生長改變腸道中菌群的數量,進而增加抗炎能力,抑制癌細胞的增殖,最終起到緩解癌癥的作用。