2-羥丙基-β-環糊精/葡萄籽提取物包合物對羊肚腐敗菌的抑制作用及保鮮效果

鐘媛媛,李文慧,盧士玲,王慶玲,冉麗丹,董 娟

（石河子大學食品學院,新疆 石河子 832000）

羊肚即羊胃,是羊的副產品之一,含有豐富的營養成分。據《本草綱目》記載,羊肚性味甘平、口感柔脆、易于消化,具有健脾補虛等功效,是一種健康食品。但在貯藏過程中,易受到內源性微生物和外界環境的影響,從而發生腐敗變質。有研究表明,不適當的屠宰、分割和貯藏會導致肉中微生物繁殖和交叉污染,包括沙門氏菌和引起食源性疾病的李斯特氏菌,造成了嚴重的經濟損失[1]。因此,尋找控制肉與肉制品在加工貯藏中微生物污染的有效方法是非常必要的。

近年來,天然抗氧化劑植物多酚抑菌機理的探究成為了熱點。Bukvi?ki等[2]將精油加入豬肉后針對單核細胞增生李斯特氏菌進行研究,發現精油處理成功地抑制了豬肉中單核細胞增生李斯特氏菌的增殖,使豬肉的顏色和風味得到明顯改善。董璐[3]、錢麗紅[4]、王慧敏[5]等研究發現,茶多酚能增加大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌、腐敗希瓦氏菌的細胞膜通透性,影響膜流動性,阻礙細菌蛋白質的正常表達,產生良好的抑菌活性。因此,植物多酚取代合成抗氧化劑和抑菌劑已是大勢所趨[6]。釀酒后的副產物葡萄籽提取物（grape seed extract,GSE）是豐富且廉價的多酚來源,主要單體是黃烷-3-醇和低聚葡萄籽原花色素（grape seed proanthocyanidins,GSP）,其中GSP可有效清除超氧化物和羥基自由基[7]。GSE的抗氧化活性受聚合度的影響,聚合程度越高,抗氧化活性越高[8]。實驗證明GSE的抗氧化活性是VE的20 倍,是VC的50 倍；同時,對人類健康具有有益的作用。另外,GSE也被證明具有很強的抗菌活性,特別是對人類致病微生物如金黃色葡萄球菌、凝固葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌和植物致病真菌[9]。

GSE廣泛應用于肉制品貯藏加工中,但其自身特性在食品工業中的應用已受到限制,因為GSE在水中的溶解度、生物利用度有限,見光易分解、吸潮,具有不穩定性。環糊精是由α-1,4-葡萄糖苷鍵連接的無毒環狀低聚糖,因為具有中空圓錐形的特殊結構,使得形狀和大小合適的疏水性客體分子或官能團能嵌入其空穴中,形成包合物[10]。而水溶性環糊精衍生物,如2-羥丙基-β-環糊精（(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin,HP-β-CD）,因具有親水外表面和親脂內腔的結構,且客體分子被封裝到腔中可以不改變宿主的化學結構而被廣泛應用在食品或醫藥領域[11-12]。已發現客體分子的許多化學和物理性質在包合物形成過程中被優化,例如客體分子的抗氧化、抗光誘導變化和熱穩定性增強,客體分子的溶解度增加、揮發性降低,有利于保持食品品質[13]。Abarca等[14]研究發現,通過共沉積法制備了精油與β-環糊精的包合物,可有效降低其揮發性,在微生物分析中,可以觀察到包合物對暴露于體外的絲狀真菌Botrytis cinerea的徑向生長有抑制的作用,證明了包合物對Botrytis cinerea的抑菌行為。巫春寧等[15]采用單因素正交試驗制備了GSE與環糊精的包合物,發現GSE通過包合,其穩定性明顯提高,同時在水中的溶解度增加了3 倍。Lucas-Abellán等[16]研究指出白藜蘆醇中酚羥基與CD羥基形成氫鍵后其自由基清除能力提高。然而,有關GSE與HP-β-CD的包合物在肉制品中防腐抑菌方面的應用鮮有報道。因此,本實驗針對HP-β-CD/GSE包合物對羊肚腐敗菌的抑制作用及保鮮效果進行了研究,以期為肉類食品防腐保鮮提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮綿羊（8 月齡）羊肚由新疆西部牧業股份有限公司提供,購買后將其裝入含有冰袋的保溫箱中快速運回實驗室,去除羊肚表面的污物及油脂后清洗干凈。

葡萄籽提取物（純度95%） 上海麥克林生化科技有限公司；HP-β-CD、蛋白酶K 北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨 天津市北方天醫化學試劑廠；DNA提取試劑盒 天根生化科技北京有限公司。

1.2 儀器與設備

Beta 2-8 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；Seamus Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；DSC200F3差示掃描量熱（differential scanning calorimetry,DSC）儀 德國耐馳儀器公司；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM） 日本電子公司；TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）儀英國Techne公司；pHS-3C標準型pH計 上海精密儀器有限公司；Mini-protein Ⅲ凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 包合物的制備

采用共沉積法制備包合物[17-18],并以不同物質的量之比（1∶0.5、1∶1、1∶2）進行HP-β-CD/GSE包合物的制備。將0.16 g GSE完全溶解在用鋁箔紙包裹的錐形瓶中,加入40 mL、體積分數30%乙醇溶液,再加入不同量的HP-β-CD以得到不同物的質量之比的二者混合溶液。將溶液置于搖床中恒溫（40 ℃）攪拌72 h后,于4 ℃的冰箱中過夜。通過抽濾獲得沉淀物并用體積分數30%乙醇洗滌后于-80 ℃下預冷24 h后,通過冷凍干燥機冷凍干燥而獲得固體HP-β-CD/GSE包合物。物理混合物是將HP-β-CD與GSE以物質的量之比1∶1在研缽中完全混合研磨制備。

1.3.2 HP-β-CD/GSE包合物的表征

1.3.2.1 FTIR光譜的測定

采用溴化鉀壓片法測定HP-β-CD/GSE包合物以及物理混合物的紅外光譜吸收曲線。使用FTIR儀以2 cm-1的分辨率在4 000～500 cm-1的范圍內掃描樣品。

1.3.2.2 熱特性的測定

將5 mg HP-β-CD/GSE包合物以及物理混合物均勻分散在坩堝中,使用DSC儀測量樣品的熱特性。樣品在30～400 ℃的范圍內掃描,升溫速率為10 ℃/min,干燥氮氣流速為25 mL/min。

1.3.2.3 微觀結構的測定

將適量HP-β-CD/GSE包合物以及物理混合物依照SEM儀操作要求制片,并進行噴金處理后,置于顯微鏡下觀察（加速電壓10 kV）。

1.3.3 羊肚中菌落總數及腐敗菌的分離、鑒定

1.3.3.1 菌落總數的測定

菌落總數的測定參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[19]。將羊肚放置在4 ℃貯藏7 d（羊肚有明顯的腐敗變質現象）,在此期間每天進行菌落總數的測定。在無菌操作臺上取5 g羊肚放入無菌操作袋中,加入45 mL、質量分數85%的生理鹽水,在勻漿器上拍打2 min,制成1∶10的樣品勻液。再用無菌鹽水進行10 倍梯度稀釋,取200 μL稀釋4、5、6 倍的3 個梯度稀釋樣液加入PCA培養基中,進行涂布后,放置在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h,平板中菌落總數在30～300之間作為有效平板。

1.3.3.2 腐敗菌的分離純化

在1.3.3.1節測定菌落總數后的平板中挑選菌落形態好的菌落在LB固體平板上進行反復劃線分離,挑取純化后的單菌落進一步在LB液體培養基中富集,取適量菌液接入體積分數30%的甘油管中,并在-80 ℃中保藏。

1.3.3.3 DNA提取與測序

使用細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取。將提取到的DNA進行16S rDNA PCR擴增,體系為：2×Planta Max MasterMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、上游引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）1 μL,下游引物1492R（5'-GGTTACCTTACGACTTGGT-3'）1 μL,DNA模板1 μL,反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,30 個循環重復；72 ℃徹底延伸5 min。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的純度,反應條件為：20 mL質量分數0.8%的瓊脂糖凝膠、2 μL核酸染料、樣品量（1 μL PCR產物+5 μL loading buffer）、電泳緩沖液1×TAE、電壓110 V、電流200 mA。電泳條帶在凝膠成像儀下進行觀察,并將凝膠條帶送至上海生工生物工程公司測序。

1.3.3.4 系統發育樹的構建

在NCBI網站輸入堿基序列,搜索BLAST進行分析比對。將同源性在98%以上的目的序列復制到文本上,用MEGA 7.0軟件構建進化樹。

1.3.4 HP-β-CD/GSE包合物對腐敗菌的抑菌實驗

參照文獻[20]的方法,采用濾紙片法做抑菌圈直徑實驗。將分離純化得到的腐敗菌挑取單菌落到營養肉湯液體培養基中,37 ℃恒溫培養活化18 h后,將得到的菌液稀釋至108CFU/mL。取100 μL稀釋后菌液均勻涂布在營養肉湯固體培養基上,放入滅菌的濾紙片,加入5 μL 5 g/L HP-β-CD/GSE包合物（1∶2,物質的量之比,后同）溶液在濾紙片上,于37 ℃培養24 h后,測定抑菌圈直徑。

1.3.5 HP-β-CD/GSE包合物對羊肚保鮮效果的測定

1.3.5.1 原料處理

將羊肚切分成長7～10 cm左右,隨機分成4 組,每組3 個平行。其中第一組不做任何處理（空白組）,第2～4組分別在5 g/L的HP-β-CD/GSE包合物（1∶0.5、1∶1、1∶2）溶液中浸泡20 min后取出晾干,裝入自封袋,4 ℃下貯藏9 d,期間每天對樣品進行指標測定。

1.3.5.2 pH值測定

在無菌操作臺上取5 g羊肚,并用滅菌后的剪刀剪碎于燒杯中,加入50 mL滅菌后的蒸餾水浸泡30 min,用pH計測定浸泡羊肚后的蒸餾水pH值,待pH計穩定后進行計數,每個樣品重復3 次。

1.3.5.3 總揮發性鹽基氮含量測定

總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）含量根據GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[21]進行測定。

1.3.5.4 感官評價

由20 位具有感官評定知識且自身健康的食品專業的老師與同學組成感官評定小組,要求小組全體成員在同一時間分別對樣品進行感官評價,且保證相互之間無任何交流。感官評分取值在0～9 分,最終取各感官項目的平均值,具體評分標準見表1。

表1 羊肚的感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of lamb tripe

1.4 數據處理與分析

每組實驗重復測定3 次,結果采用SPSS Statistics 17.0軟件進行數據分析,使用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 HP-β-CD/GSE包合物結構與特性的表征

2.1.1 FTIR分析結果

圖1 不同主客體比包合物的FTIR圖Fig.1 FTIR spectra of inclusion complexes with different host/guest ratios

FTIR能夠為分析固體中環糊精和客體分子間的相互作用提供有效信息[22]。共沉積法制備的不同物質的量之比的HP-β-CD/GSE包合物、HP-β-CD/GSE物理混合物、HP-β-CD及GSE的FTIR圖如圖1所示。GSE在3 431 cm-1處顯示出特征吸收峰,這可能是由于酚羥基中的O—H鍵的伸縮振動,特征骨架振動主要集中在1 000～1 650 cm-1和700～850 cm-1區域。HP-β-CD在3 416.08 cm-1處有明顯的—OH伸縮振動吸收帶,在2 928.33 cm-1處存在—CH伸縮振動峰,在1 159 cm-1處和1 032 cm-1處為C—O—C的對稱和不對稱伸縮振動峰[23]。在形成HP-β-CD/GSE包合物后,GSE特征峰逐漸減少（主要呈現HP-β-CD的峰）,移位或丟失。GSE中對應的苯骨架在3 431 cm-1處的吸收峰輕微移動至3 410 cm-1,1 000～500 cm-1處的C—O拉伸振動被HP-β-CD的特征性吸收峰被遮蔽,這可能是HP-β-CD/GSE包合物的形成所致[24],表明GSE可能已完全嵌入HP-β-CD的空腔中。物理混合物是HP-β-CD和GSE單一組分之間的FTIR光譜的簡單疊加。FTIR的結果證實了HP-β-CD/GSE包合物的形成,結果與Pu Hongyu等[25]用HP-β-CD包合特丁基對苯二酚的研究結果一致。

2.1.2 熱特性分析結果

圖2 不同主客體比包合物的DSC圖Fig.2 DSC patterns of inclusion complexes with different host/guest ratios

由圖2可知,GSE在238.21 ℃處出現了急劇的吸熱熔融峰。對于HP-β-CD,在82.56 ℃處顯示出較寬的吸熱熔融峰,這與HP-β-CD水分損失有關；在349.38 ℃處觀察到第二吸熱熔融峰,這可能是熱分解所致。物理混合物的DSC曲線是HP-β-CD和GSE曲線的簡單疊加,該結果表明這兩種物質僅物理混合但彼此不相互作用。

在具有不同物質的量之比的HP-β-CD/GSE包合物中,除了在283 ℃處GSE熔融峰的消失外,HP-β-CD/GSE（1∶0.5）包合物的DSC曲線中其特征吸收峰僅在71.15 ℃處很明顯。在HP-β-CD/GSE（1∶1）包合物的DSC曲線中,在74.99 ℃和341.70 ℃處有兩個吸熱熔融峰。在HP-β-CD/GSE（1∶2）包合物的DSC曲線中,在73.65 ℃和323.35 ℃處存在兩個吸熱熔融峰,這可能是由于在包合物形成過程中HP-β-CD和GSE之間形成新的分子間或分子內鍵,使GSE的熔點消失,并且在GSE和HP-β-CD之間形成包合物HP-β-CD后,熱性質發生改變,導致熔融峰的移動[26]。DSC分析可用于確定固體包合物的形成,且包合物中客體分子的熱峰消失進一步表明包合物的成功制備[27]。

2.1.3 微觀結構觀察結果

SEM可用于觀察物質和電子之間相互作用后的表面形態,是一種檢測包合物形成的輔助方法[28]。如圖3所示,GSE呈現針狀菱形晶體形態,而HP-β-CD呈球形。在HP-β-CD和GSE的物理混合物中兩種形態都能被觀察到,為不規則的嵌段結構和片段化的球形結構,其中宿主（HP-β-CD）和客體（GSE）的形式未改變。包合物的形狀與物理混合物的形狀完全不同,其呈現出具有球形腔或腔體碎片結構表面的多層塊結構。不同物質的量之比的HP-β-CD/GSE包合物的表面形態不同；HP-β-CD/GSE（1∶0.5）的包合物呈圓球形嵌段結構,而1∶1和1∶2比例的包合物呈現不規則的層狀結構。研究表明,當客體分子包含在β-CD中時,包合物的表面由于客體分子結晶度的降低而發生很大變化[29]。在HP-β-CD/GSE包合物中,兩種組分的原始形態完全喪失,并被不規則尺寸的小聚集體取代。因此,FTIR、DSC和SEM的結果表明HP-β-CD/GSE包合物制備成功。

圖3 不同主客體比包合物的SEM圖Fig.3 SEM of inclusion complexes with different host/guest ratios

2.2 羊肚中的菌落總數及腐敗菌的分離、鑒定結果

2.2.1 貯藏過程中羊肚的菌落總數變化

圖4 4 ℃貯藏過程中羊肚的菌落總數Fig.4 Total number of colonies in lamb tripe stored at 4 ℃

如圖4所示,新鮮羊肚的菌落總數為3.91（lg（CFU/g））,在貯藏的前4 d,菌落總數呈現快速上升的趨勢,可能是由于在此期間羊肚中的微生物處于對數生長期,微生物利用羊肚中的營養物質后進行大量繁殖。隨后,微生物的繁殖與營養物質達到平衡狀態,在貯藏第5天菌落總數為7.52（lg（CFU/g））。一般來說,生鮮肉定菌落總數高于6（lg（CFU/g））時表示肉品質已經腐敗變質[30],而羊肚在貯藏第2天時的菌落總數已高于6（lg（CFU/g））,說明已腐敗變質。

2.2.2 腐敗菌的鑒定及進化樹的構建結果

圖5 分離腐敗菌株的16S rDNA PCR擴增電泳圖Fig.5 Electrophoresis pattern of 16S rDNA polymerase chain reaction amplification products of isolated spoilage strains

對羊肚中微生物進行分離純化后,共篩選出7 株腐敗菌,對7 株腐敗菌進行DNA提取和PCR擴增,擴增后的條帶如圖5所示,特異性擴增條帶均出現在1 250 bp左右,且條帶清晰、無雜帶。

對條帶進行測序后,在BLAST上比較測序結果,選擇了98%以上的相似菌株,并使用MEGA 7.0構建了腐敗菌系統發育樹（圖6）,得到分離純化出的7 株腐敗菌菌株分別為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、吉氏庫特菌（Kurthia gibsonii）、腸溶沙門氏菌亞種（Salmonella entericasubsp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、棕色類香味菌（Myroiddes phaeus）。

圖6 基于16S rRNA序列的同源性菌株系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of homologous strain based on 16S rRNA sequence

2.3 HP-β-CD/GSE包合物（1∶2）對腐敗菌的抑制作用

實驗中發現物質的量比為1∶2時包合物的抗氧化效果最好,且物質的量比為1∶0.5和1∶1對腐敗菌的抑制效果沒有1∶2時好（未列出相應實驗結果）,所以只對1∶2的最優效果進行討論。從表2可以看出,HP-β-CD/GSE包合物（1∶2）對分離的7 種菌均具有一定的抑菌效果,其中對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性效果最強,其次是表皮葡萄球菌。圖7為抑菌實驗中包合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌結果。

表2 包合物（1∶2）對7 株腐敗菌的抑制作用結果Table 2 Inhibitory effect of inclusion complex (1:2) on seven strains of spoilage bacteria

圖7 包合物（1∶2）對金黃色葡萄球菌（A）及大腸桿菌（B）的抑菌效果Fig.7 Antibacterial effect of inclusion complex (1:2) against Staphylococcus aureus (A) and Escherichia coli (B)

2.4 HP-β-CD/GSE包合物對羊肚的保鮮效果

2.4.1 pH值的變化

圖8 貯藏期間羊肚的pH值變化Fig.8 Changes in pH of lamb tripe during storage

pH值影響肉的品質（如持水性、風味）和貨架期,可以作為評價肉的新鮮度的指標之一[31]。如圖8所示,空白組中的羊肚在第0天時pH值為6.62,而處理組的pH值在第0天時為6.53,處理組的pH值低于空白組可能是因為與HP-β-CD/GSE包合物溶液本身的pH值有關。在貯藏期間羊肚的pH值均呈現緩慢上升趨勢,可能是因為蛋白質在組織蛋白酶類和腐敗微生物作用下逐漸分解產生氨基酸,隨后繼續分解為氨和三甲胺等堿性物質[32]。不同物質的量之比的HP-β-CD/GSE包合物（1∶0.5、1∶1、1∶2）處理的羊肚在貯藏期間的pH值始終低于空白組,說明在使用HP-β-CD/GSE包合物溶液浸泡后,GSE進入羊肚的組織中,抑制了羊肚中的蛋白降解,減緩了羊肚腐敗變質的過程。相比較下,1∶2 HP-β-CD/GSE包合物處理組的羊肚pH值在貯藏的前6 d保持在較小的范圍波動,這對羊肚品質保持十分有利。

2.4.2 TVB-N含量的變化

圖9 貯藏期間羊肚TVB-N含量的變化Fig.9 Changes in TVB-N content of lamb tripe during storage

TVB-N指在酶和微生物的作用下,肉制品中的蛋白質腐敗分解產生氨及胺類等具有揮發性堿性含氮類物質[33]。TVB-N含量越高,表明肉制品中蛋白質破壞分解得越多,因此TVB-N含量在很大程度上能反映肉制品的新鮮度[34]。如圖9所示,在第0天時,新鮮的羊肚中TVB-N含量為8 mg/100 g左右。在后期貯藏過程中,各處理組的TVB-N含量均呈現上升的趨勢。空白組中TVB-N含量上升趨勢較快,貯藏期在第2天時已超過GB 9961—2008《鮮、凍胴體羊肉》中對鮮肉TVB-N的限量15 mg/100 g。而不同物質的量之比的HP-β-CD/GSE包合物（1∶0.5、1∶1、1∶2）處理的羊肚在貯藏期間的TVB-N含量始終低于空白組,說明HP-β-CD/GSE包合物能有效抑制由微生物引起的TVB-N含量增加。其中,物質的量比為1∶2的HP-β-CD/GSE包合物TVB-N含量增長較緩慢,在貯藏的前6 d均低于15 mg/100 g,保鮮效果較好,這一結果與pH值的變化趨勢相似。

2.4.3 感官品質的變化

圖10 貯藏期間羊肚的感官評分Fig.10 Sensory evaluation of sheep tripe during storage

感官評分是品評人員對羊肚在貯藏過程中直觀判定的結果,根據羊肚的顏色、質地、氣味進行打分,該得分可以用于輔助理化指標判定羊肚在冷藏過程中的品質變化。在貯藏開始時,羊肚的顏色色澤均勻,富有光澤,有彈性,質地堅實,具有羊肚固有濃郁氣味,無異味。貯藏2 d后,空白組的感官評分明顯低于用HP-β-CD/GSE包合物處理組。貯藏時間超過4 d后,空白組色澤極度不均勻,羊肚表面水分過多,無彈性,質地非常柔軟,固有氣味消失,有明顯異味,感官評分小于6 分,并呈現急速下降趨勢；包合物處理組（除1∶0.5）在6 d內感官評分大于6,保持在可接受范圍。結果表明,HP-β-CD/GSE包合物處理組可有效延長羊肚的貨架期3～4 d,與理化指標研究結果一致。

3 結 論

本實驗以HP-β-CD為主體成功制備了不同物質的量之比（1∶0.5、1∶1、1∶2）的HP-β-CD/GSE包合物,利用FTIR、DSC和SEM表征手段證明了包合物的形成。另外,對羊肚腐敗菌進行分離后,鑒定出了表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、吉氏庫特菌（Kurthia gibsonii）、腸溶沙門氏菌亞種（Salmonella entericasubsp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、棕色類香味菌（Myroiddes phaeus）7 株主要腐敗菌,且HP-β-CD/GSE包合物（1∶2）對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用。將HP-β-CD/GSE包合物應用于羊肚的保鮮（4 ℃）中,發現其對羊肚的品質起到一定的保持作用,且物質的量之比為1∶2的HP-β-CD/GSE包合物對羊肚的抑菌保鮮效果較好。