樂(lè)伐替尼誘導(dǎo)肝癌耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性探析*

楊哲豪，喻超，潘耀振，鄧路，鄭迪杰，孫誠(chéng)誼*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州醫(yī)科大學(xué) 肝膽胰脾重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550004)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌的主要組織學(xué)類型，發(fā)病占原發(fā)性肝癌的85%～90%[1-2]。HCC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移與細(xì)胞內(nèi)的各種級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是息息相關(guān)的，而細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中存在的多個(gè)關(guān)鍵性基因或是信號(hào)分子，乃是分子靶向治療的重要潛在作用靶點(diǎn)[3-4]。分子靶向藥物在臨床應(yīng)用上雖然具有不良反應(yīng)少和療效較為突出等優(yōu)點(diǎn)，靶向藥物還是存在著原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥的問(wèn)題[5-6]。樂(lè)伐替尼(levatinib)是一種口服的多靶點(diǎn)酪氨酸激酶受體抑制劑，主要以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGFR)、酪氨酸激酶受體編碼基因(rearranged during transfection，RET)、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)及血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factor,PDGFR)等為作用靶點(diǎn)[7-10]，經(jīng)3期臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，樂(lè)伐替尼在改善患者無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和客觀緩解率(objective response rate，ORR)等方面展示出優(yōu)于索拉菲尼的效果[11-12]，現(xiàn)已被美國(guó)食品及藥物管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)應(yīng)用于治療不可切除的肝細(xì)胞癌[9]，然而HCC靶向治療中不可避免出現(xiàn)耐藥性[5]，目前針對(duì)HCC治療過(guò)程中產(chǎn)生樂(lè)伐替尼耐藥后的治療方案研究尚比較缺乏。本研究采用藥物逐步遞增法，于體外建立樂(lè)伐替尼作用下HCC的分子靶向藥物耐藥細(xì)胞株SMMC-7721，初步探究耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性及相關(guān)機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與藥品 肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由本實(shí)驗(yàn)室保存，樂(lè)伐替尼(批號(hào)S116410，10 mol/L)、阿霉素(批號(hào)S120810，10 mol/L)、氟尿嘧啶(批號(hào)S1209，100 mg)及順鉑(批號(hào)S116010，10 mol/L)購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance protein，MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance protein，LRP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶pi(glutathione-s-transferase pi，GST-pi)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱɑ(topoisomeraseⅡɑ，TopoⅡɑ)及乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BRCP)抗體購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司，DMEM、胎牛血清、胰酶及相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)及Western blot相關(guān)試劑均購(gòu)置于武漢谷歌生物科技公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；CFX96 Touch熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司，ChemiDocTMTouch Bio-rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取人HCC細(xì)胞株SMMC-7721培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好、密度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.2.2耐藥細(xì)胞株的建立及分組 應(yīng)用藥物逐步遞增法誘導(dǎo)得到耐藥細(xì)胞株。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞接種于含初始濃度100 nmol/L樂(lè)伐替尼和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，適時(shí)更換加藥培養(yǎng)基，初期可見(jiàn)大量細(xì)胞漂浮、死亡，待2～3周細(xì)胞貼壁穩(wěn)定生長(zhǎng)后，用不加藥培養(yǎng)基培育3～5 d后傳代，繼續(xù)倍增濃度重復(fù)上述操作，最終誘導(dǎo)濃度為3.6 μmol/L，并于終止最終濃度持續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，歷時(shí)8個(gè)月構(gòu)建樂(lè)伐替尼耐藥HCC細(xì)胞株SMMC-7721；后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以未經(jīng)處理的細(xì)胞為對(duì)照組，誘導(dǎo)后產(chǎn)生耐藥的細(xì)胞為耐藥組。

1.2.3CCK8法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性 取對(duì)數(shù)期長(zhǎng)勢(shì)良好的對(duì)照組和耐藥組細(xì)胞用胰酶消化、吹打，制備為細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并稀釋；分別以3×103個(gè)/孔接種于96孔板中，并預(yù)留不含細(xì)胞的空白組，置于37 ℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入含相應(yīng)藥物濃度的培養(yǎng)基200 μL/孔，樂(lè)伐替尼起始濃度為0.001μmol/L，阿霉素、氟尿嘧啶及順鉑起始濃度均為0.01 μmol/L，每種藥物均10倍稀釋5個(gè)梯度濃度，每個(gè)濃度處理5個(gè)復(fù)孔；繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，分別于每孔中加入CCK-8試劑10 μL，避光培養(yǎng)1 h；采用酶聯(lián)免疫分析儀檢測(cè)樣品在490 nm處吸光值并計(jì)算各梯度濃度樂(lè)伐替尼、阿霉素、氟尿嘧啶及順鉑作用下的細(xì)胞生存率；采用Graphpad prism8.0軟件繪圖并計(jì)算不同藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration，IC50)和樂(lè)伐替尼的耐藥指數(shù)(resistance index,RI)。

1.2.4Real time-PCR檢測(cè)耐藥基因MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，培養(yǎng)基中和，800 r/min離心5 min，棄上清，加Trizol試劑1 mL裂解細(xì)胞，提取總RNA并檢測(cè)RNA濃度和純度；依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將樣品逆轉(zhuǎn)錄為cRNA，以GAPDH作為內(nèi)參，使用SYBR Premix ExTaq試劑盒進(jìn)行Real time-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP基因的表達(dá)。

1.2.5Western blot 檢測(cè)P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP蛋白的表達(dá) 取各組細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)，將膜用5%脫脂奶封閉1.5 h，并在對(duì)應(yīng)條件下與P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ和BCRP一抗、二抗溫育，洗膜、曝光后，用Image lab檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算各耐藥基因相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1耐藥細(xì)胞對(duì)樂(lè)伐替尼的耐藥性

用時(shí)8個(gè)月，在體外誘導(dǎo)出樂(lè)伐替尼耐藥細(xì)胞株SMMC-7721，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組和耐藥組細(xì)胞的IC50分別為(0.15±0.03)μmol/L和(4.34±0.12)μmol/L，RI為28，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。圖1 對(duì)照組和耐藥組細(xì)胞的樂(lè)伐替尼濃度-細(xì)胞存活率曲線Fig.1 Levatinib concentration-cell survival curves of cells of the control and drug-resistant groups

2.2耐藥SMMC-7721細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的敏感性

與對(duì)照組比較，阿霉素、氟尿嘧啶和順鉑對(duì)耐藥組SMMC-7721細(xì)胞的IC50均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。圖2 不同化療藥物下對(duì)照組和耐藥組細(xì)胞的IC50比較 Fig.2 Median inhibition concentrations of different chemotherapeutic agents in cells of the control and drug-resistant groups

2.3耐藥SMMC-7721細(xì)胞中MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP基因的表達(dá)

與對(duì)照組相比，耐藥組SMMC-7721細(xì)胞的MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ和BCRP耐藥基因的相對(duì)表達(dá)量均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖3 對(duì)照組和耐藥組SMMC-7721細(xì)胞中MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ和BCRP耐藥基因的表達(dá)Fig.3 Experession of drug-resistance genes MDR1，LRP，MRP2，GST-pi，TopoⅡɑ and BCRP in SMMC-7721 cells of the control and drug-resistant groups

2.4耐藥SMMC-7721細(xì)胞中P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組比較，耐藥組SMMC-7721細(xì)胞中P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP蛋白表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖4 對(duì)照組和耐藥組SMMC-7721細(xì)胞中P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of P-gp,LRP,MRP2,GST-pi,TopoⅡɑ and BCRP protein in cells of the control and drug-resistant groups

3 討論

靶向治療是目前晚期HCC治療的重要手段，索拉菲尼作為第一批應(yīng)用于晚期HCC治療的分子靶向藥物，但因其反應(yīng)率低、毒副作用大以及短期獲得性耐藥等問(wèn)題，使患者收益大打折扣[5]。近兩年，隨著臨床實(shí)驗(yàn)中樂(lè)伐替尼治療晚期HCC療效和安全性被逐漸證實(shí)，為臨床上靶向治療晚期HCC提供更多選擇[11]。有研究者發(fā)現(xiàn)，在建立非小細(xì)胞肺癌奧希替尼耐藥細(xì)胞株后其對(duì)化療藥物敏感性增強(qiáng)[13]。對(duì)于HCC產(chǎn)生樂(lè)伐替尼耐藥后對(duì)其他治療藥物的敏感性，尚未有研究報(bào)道。目前有研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性與多藥耐藥有關(guān)[14-16]，而產(chǎn)生多藥耐藥的原因十分復(fù)雜，研究報(bào)道參與多藥耐藥的基因主要有：MDR1和MRP可以以跨膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的方式排除化療藥物，MDR1編碼的P-gp還可活化抗凋亡通路使細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受[17-19]；glutathione-s-transferase，GST以其藥物代謝酶作用降低化療敏感性[20-21]；LRP以胞吐作用排出抗腫瘤藥物[22-23]；TopoⅡ可導(dǎo)致藥物靶點(diǎn)不易與DNA形成復(fù)合物使得靶點(diǎn)對(duì)抗腫瘤藥藥物敏感性降低[24-25]；BCRP可調(diào)控細(xì)胞毒性物質(zhì)的排出[26]。大量體外研究表明，MDR1、MRP、GST及BCRP等基因表達(dá)與肝癌細(xì)胞多藥耐藥性呈正相關(guān)趨勢(shì)，并且與阿霉素、氟尿嘧啶等藥物治療的敏感性密切相關(guān)[14]。

本研究通過(guò)藥物逐步遞增法誘導(dǎo)耐樂(lè)伐替尼的SMMC-7721細(xì)胞株，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樂(lè)伐替尼對(duì)對(duì)照組和耐藥組細(xì)胞的IC50，并計(jì)算出RI值為28，提示成功于體外建立耐樂(lè)伐替尼的SMMC-7721耐藥細(xì)胞株。為了探究樂(lè)伐替尼耐藥后細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性變化，繼續(xù)通過(guò)CCK-8檢測(cè)耐藥細(xì)胞對(duì)阿霉素、氟尿嘧啶和順鉑的IC50發(fā)現(xiàn)較對(duì)照組細(xì)胞明顯降低，即耐藥細(xì)胞對(duì)上述藥物敏感性增強(qiáng)。進(jìn)一步了解產(chǎn)生敏感性變化的潛在機(jī)制，通過(guò)檢測(cè)MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡα及BCRP的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在mRNA水平還是蛋白水平，耐藥組細(xì)胞中表達(dá)量均低于對(duì)照組。結(jié)果表明耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性增強(qiáng)與上述多藥耐藥基因的表達(dá)量降低有關(guān)。

綜上所述，本研究成功誘導(dǎo)得到耐樂(lè)伐替尼的HCC細(xì)胞株SMMC-7721，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)阿霉素、氟尿嘧啶和順鉑的敏感性增高，可能與耐藥細(xì)胞中MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡα及BCRP基因的表達(dá)量下降有關(guān)。有望在臨床靶向治療肝細(xì)胞癌產(chǎn)生樂(lè)伐替尼耐藥后提供新的治療思路。具體作用方式和分子機(jī)制還需進(jìn)一步探究。