SYT1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制*

許靜，喻超，楊盛力，孫誠(chéng)誼**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 肝膽胰脾重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550004)

惡性腫瘤屬于國(guó)內(nèi)臨床病死率較高的疾病，而肝癌是導(dǎo)致癌癥死亡的五大主要原因之一[1-2]。肝癌的發(fā)生具有種族和區(qū)域差異性，高發(fā)于發(fā)展中國(guó)家，中國(guó)每年新增肝癌病例數(shù)占全世界的二分之一以上[3]。肝癌早期癥狀并不明顯，腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)在癌癥初期的敏感性低[4]，超聲檢查雖能提高檢出率，但受檢查者的臨床經(jīng)驗(yàn)以及機(jī)器的先進(jìn)程度影響[5-8]，因此患者確診時(shí)往往已是中晚期；且肝癌惡性程度較高，病情進(jìn)展快且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移[9]，因此，亟需找到更有效的分子治療靶點(diǎn)以獲得更好的抗癌方法。突觸囊泡蛋白(synaptotagmin, SYT)家族在人體內(nèi)廣泛分布，已知有多于17種的亞型，突觸囊泡蛋白1 (synaptotagmin, SYT1) 作為突觸小泡膜表面的Ca2+傳感器，在胞吞胞吐以及囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)起至關(guān)重要的作用[10-12]。研究認(rèn)為，SYT1能抑制直腸癌細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)其死亡[13]，而SYT1在肝癌中的作用尚未有相關(guān)報(bào)道。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，抑制SYT1的表達(dá)能明顯降低癌細(xì)胞的增殖率，有望在肝癌治療上找到新思路。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)主要發(fā)生于上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤，指上皮表型轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型的現(xiàn)象，該過(guò)程涉及復(fù)雜的分子機(jī)制，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可觀察到腫瘤細(xì)胞中鈣黏附蛋白E(E-cadherin)的表達(dá)下降，而波形蛋白(Vimentin)表達(dá)增多[14-17]，因此，可檢測(cè)這兩種蛋白的表達(dá)量來(lái)驗(yàn)證腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。本文通過(guò)抑制SYT1表達(dá)后研究其對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力帶來(lái)的影響，探討沉默SYT1后抑制肝癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑

在本研究中所使用的肝癌細(xì)胞株為Hep3B、Huh7、HCCLM3、SMMC-7721、HLF和BEL-7404，正常肝細(xì)胞HL-7702，由武漢華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，所使用的表達(dá)質(zhì)粒為si-SYT1，DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基、胰蛋白酶(TRYPSIN)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購(gòu)自美國(guó)gibco公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司的ECM550，RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，引物SYT1、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、si-SYT1試劑盒均由武漢谷歌生物科技有限公司提供，proteintech公司提供SYT1、E-cadherin、 Vimentin一抗，CPTransfection kit 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州銳博公司，4%多聚甲醛固定液、蘇木精、結(jié)晶紫購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用加了10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞Hep3B、Huh7、HCCLM3、SMMC-7721、HLF和BEL-7404，以及正常肝細(xì)胞HL-7702，并將Hep3B、Huh7根據(jù)轉(zhuǎn)染的載體不同分組后，置于37 ℃、含5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B、Huh7細(xì)胞，2×105個(gè)/孔，均勻置于六孔板中培養(yǎng)，待6 h細(xì)胞貼壁，換液后，用SYT1表達(dá)空載體、SYT1干擾慢病毒及SYT1過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染兩株細(xì)胞，分別為SYT1對(duì)照組(對(duì)照組)、SYT1干擾下調(diào)組(干擾組)和SYT1過(guò)表達(dá)組(過(guò)表達(dá)組)，用lipofectamine3000促進(jìn)轉(zhuǎn)染。

1.2.3SYT1在肝癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá) 選取肝膽胰外科自2010年7月—2019年5月收集的150例原發(fā)性肝癌患者，采用免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察SYT1在肝癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)。用4%多聚甲醛固定肝癌組織及癌旁組織，石蠟包埋，組織切片置于68 ℃恒溫箱中，烘烤20 min，二甲苯浸泡20 min，更換二甲苯溶液再次浸泡20 min；依次用無(wú)水乙醇、80%乙醇、70%乙醇、3%H2O2分別浸泡10 min，用PBS洗去切片表面的其他液體(洗3次，每次5 min)；再用0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液浸泡，并加熱至95 ℃，加熱20 min，再靜置30 min待其冷卻；用PBS溶液洗3次；室溫下，用正常羊血清工作液封閉10 min；滴加一抗4 ℃過(guò)夜后，用PBS緩沖液洗3次，室溫下加入二抗反應(yīng)1 h, PBS緩沖液洗3次；DAB顯色液染色10 min，PBS沖洗10 min，蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗10 min，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察SYT1在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。

1.2.4SYT1在不同肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞中的表達(dá) 用Trizol溶液提取RNA，SYBR Premix ExTaq試劑盒進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)：經(jīng)去基因組、總RNA純度和完整性檢測(cè)后，將樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，qPCR反應(yīng)體系為5μmol/L qPCR primer 0.9 μL, SYBR(2X) 7.5μL,DdH2O 5.6 μL,待檢測(cè)樣品 1 μL,經(jīng)95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s,循環(huán)40次。SYT1引物F鏈為GCTGCTGGTAGGGATCATTCR鏈為GTTTTTCGGTGGACTTTTGTCTC，GAPDH引物F鏈為GGAGCGAGATCCCTCCAAAATR鏈為GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

1.2.5SYT1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B、Huh7細(xì)胞，將細(xì)胞分為對(duì)照組和干擾組。利用由醫(yī)用級(jí)硅膠制作的OrisTM細(xì)胞接種限位塞(cell seeding stoppers)，將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)的外環(huán)形區(qū)，接種數(shù)為 40 000 個(gè)/孔，設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔。6 h后細(xì)胞貼壁，更換培養(yǎng)液并用Calcein-AM進(jìn)行細(xì)胞染色，染色30 min后，使用Cell Analyzer 6500HS機(jī)器采集圖像，作為0 h圖像。然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再次采集圖像,計(jì)算遷移率。遷移比率=(干擾組遷移48 h的細(xì)胞面積-干擾組遷移0 h的細(xì)胞面積)/(對(duì)照組遷移48 h的細(xì)胞面積-對(duì)照組遷移0 h的細(xì)胞面積)。

1.2.6SYT1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 將轉(zhuǎn)染后的Hep3B、Huh7細(xì)胞分為對(duì)照組、干擾組和過(guò)表達(dá)組，用帶有基質(zhì)膠的transwell小室和不帶基質(zhì)膠的transwell小室，分別進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/mL。取200 μL 鋪于Transwell小室上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后取出Transwell小室上室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，固定后結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下拍照和計(jì)數(shù)，結(jié)果取平均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.2.7E-cadherin和Vimentin在Hep3B、Huh7細(xì)胞中的表達(dá) 待Hep3B、Huh7細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%～90%后(約72 h)，將細(xì)胞置于冰上用RIPA裂解，提取總蛋白；5×loading buffer于100 ℃隔水加熱7 min，用90 V恒壓電泳、200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，4 ℃一抗搖床孵育過(guò)夜，室溫下二抗孵育2 h；洗膜，檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1SYT1 mRNA和蛋白在肝癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)

在肝癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中SYT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.68 ± 0.21、4.36 ± 0.33，與癌旁組織比較，肝癌組織中SYT1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A為SYT1 mRNA的表達(dá)(qPCR檢測(cè)結(jié)果)，B為SYT1蛋白免疫組化結(jié)果(HE,×100)；(1)與癌旁組織比較，P<0.05。圖1 SYT1 mRNA和蛋白在肝癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of SYT1 mRNA and protein in liver cancer tissues and para-carcinoma tissues

2.2SYT1在不同肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞中的表達(dá)

正常肝細(xì)胞HL-7702中SYT1的表達(dá)低于6株肝癌Huh7、Hep3B、HCCLM3、SMMC-7721、HLF和BEL-7404細(xì)胞，其中SYT1在Huh7和Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)又高于其他肝癌細(xì)胞(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：(1)HL-7702與比較，P<0.05。圖2 SYT1在不同肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of SYT1 in different hepatocellular carcinoma cells and normal liver cells

2.3SYT1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

OrisTM細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hep3B和Huh7干擾組細(xì)胞遷移能力低于對(duì)照組，Hep3B、Huh7的細(xì)胞遷移比率分別為0.880 2、0.872 4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)，提示干擾SYT1的表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力降低。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，Hep3B和Huh7干擾組細(xì)胞遷移數(shù)降低，過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1和圖4)；與對(duì)照組比較，Hep3B和Huh7干擾組細(xì)胞中代表肝癌細(xì)胞侵襲能力的細(xì)胞數(shù)目較少，過(guò)表達(dá)組的侵襲細(xì)胞增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2和圖4)，提示過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞侵襲、遷移能力明顯高于對(duì)照組及干擾組的肝癌細(xì)胞。

表1 各組Hep3B和Huh7細(xì)胞Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)遷移細(xì)胞數(shù)Tab.1 The number of migration cells in Transwell cell migration test in Hep3B and Huh7 cells of each group

表2 各組Hep3B和Huh7細(xì)胞Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)遷移細(xì)胞數(shù)Tab.2 The number of migration cells in Transwell cell invasion test in Hep3B and Huh7 cells of each group

2.4SYT1對(duì)肝癌細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，干擾組Hep3B、Huh7細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)量增加，而Vimentin蛋白表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。見(jiàn)圖5。

圖3 干擾SYT1的表達(dá)對(duì) Hep3B和Huh7細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of knockdown of SYT1 expression on cell migration ability in Hep3B and Huh7 cells of each group

注：A、B為T(mén)ranswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C、D為T(mén)ranswell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。圖4 SYT1對(duì) Hep3B和Huh7細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Fig.4 Effect of SYT1 on cell migration and invasion in Hep3B and Huh7 cells of each group

圖5 SYT1對(duì) Hep3B和Huh7細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響(Western blot)Fig.5 Effect of SYT1 on E-cadherin and Vimentin expression in Hep3B and Huh7 cells of each group(Western blot)

3 討論

越來(lái)越多的研究顯示SYT1不僅在轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡時(shí)起著至關(guān)重要的作用[18-19]，也可影響認(rèn)知功能[20]、與阿茨海默癥相關(guān)[21]、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等[22]。然而，SYT1在肝癌領(lǐng)域的研究尚少，對(duì)于它的作用機(jī)制更是尚未清楚。本研究探究了SYT1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移影響，并尋找其可能的分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低SYT1的表達(dá)后，明顯降低了肝癌的侵襲和遷移能力，這對(duì)于提高肝癌患者的預(yù)后有著積極的意義。接著又探究SYT1對(duì)鈣粘附蛋白E和波形蛋白表達(dá)的影響，以期尋找SYT1促進(jìn)肝癌侵襲遷移與EMT的關(guān)系。

本研究干擾SYT1的表達(dá)后，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Vimentin和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步探究SYT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力的分子作用機(jī)制與EMT的相關(guān)性。SYT1在肝癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)明顯高于癌旁細(xì)胞，表明該基因與肝癌相關(guān)。Transwell和OrisTM細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SYT1的下調(diào)使得肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力下調(diào)，提示肝癌的侵襲遷移與該基因密切相關(guān)。Western blot實(shí)驗(yàn)又證明了SYT1可以促進(jìn)EMT的發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，SYT1作為一種膜蛋白，可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖、遷移，從而促進(jìn)肝癌的惡化進(jìn)程；還證實(shí)了，SYT1表達(dá)的降低，使Vimentin表達(dá)降低而E-cadherin的表達(dá)升高，說(shuō)明SYT1促進(jìn)了EMT的發(fā)生，這可能是SYT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)途徑。