毛竹莖稈快速生長期類囊體膜蛋白復合物BN-PAGE分析

傅盧成，卜柯麗，王靈杰，栗青麗，高培軍，高 巖，張汝民

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

植物進行光合作用的主要器官是葉片，研究發(fā)現(xiàn)不僅植物葉片能夠進行光合作用，其他綠色非葉器官也能夠進行光合作用[1?3]。NILSEN[3]發(fā)現(xiàn)植物綠色莖稈具有與葉片相似的光合能力；MANETAS[4]研究發(fā)現(xiàn)大量的光照(10%～50%)是被樹干吸收的；SUN等[5]研究表明：樹干木質部和韌皮部纖維以及管胞管壁對不同方向照射光線具有良好的莖向導光特性。HIBBERD等[6]發(fā)現(xiàn)：C3植物煙草Nicotiana tabacum和芹菜Apium graveliens莖中具有C4光合途徑。NILSEN[3]認為雖然景天酸代謝途徑(CAM)植物葉片多為C3途徑，但其莖稈多為CAM途徑，其他植物莖稈光合為C3途徑。占東霞等[7]對棉花Gossypium hirsutum葉片和非同化器官的研究證明了非同化器官對光合作用的貢獻。類囊體是葉綠體中光能向化學能轉化的主要場所，一直是光合作用研究的熱點[8]。類囊體膜又稱光合膜，光合作用的4個多亞基蛋白復合體——光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)、光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)、ATP合成酶(ATP-ase)和細胞色素b6f復合體(Cytb6f)都定位在類囊體膜上[9?10]，這些蛋白復合體和許多其他輔助因子共同完成光合電子傳遞和光合磷酸化的過程[11]。高榮孚等[12]用含有聚乙二醇(PEG)的提取液提取和分離了油松Pinus tabulaeformis和豌豆Pisum sativum的類囊體膜，并得到完整的PSⅠ，證明存在2種PSⅠ，而且這種存在具有一定普遍性。蔡霞等[13]在低溫(83 K)下利用穩(wěn)態(tài)熒光光譜技術對PSⅡ核心復合物中激發(fā)能的傳遞進行了研究，發(fā)現(xiàn)最大峰所在位置沒有因激發(fā)波長的不同而發(fā)生改變；在不同波長光的激發(fā)下，核心復合物中能量傳遞的途徑不同。周偉等[14]利用藍綠溫和膠電泳(BN-PAGE)、結合質譜鑒定對條斑紫菜Porphyra yezoensis類囊體膜蛋白復合物進行了研究，檢測到PSⅡ核心復合物中D2、D1、CP47、CP43和Cytochrome f等蛋白。在分子水平上揭示各種膜蛋白復合體的結構與功能，對于揭示光能轉化的機理具有重要意義[15]。毛竹Phyllostachys edulis是江浙地區(qū)極富經(jīng)濟和生態(tài)價值的竹種。目前，對毛竹的研究主要在毛竹光合生理特性[16]、莖葉綠素熒光特征和光合酶活性[17?18]、碳水化合物代謝[19?20]、蛋白組學[21]和基因組學[22]等方面。關于毛竹莖稈類囊體膜蛋白復合物、快速生長期毛竹莖稈光合特性的研究未見報道。本研究通過分析毛竹莖稈快速生長期葉片和莖稈的光合色素含量、77 K低溫熒光發(fā)射光譜、藍綠溫和膠電泳來揭示類囊體膜蛋白復合物的變化，為闡明毛竹莖稈光合作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年5月初，在浙江省杭州市臨安區(qū)現(xiàn)代毛竹示范園內，選取生境條件一致、生長狀況良好、株高(6.0±0.2) m、基徑約15 cm、自然狀態(tài)下的當年生毛竹筍竹，從莖稈基部將其伐倒，將節(jié)間按照從基部至頂部的順序編號，1～6節(jié)(筍衣完全脫落)為莖稈基部，7～13節(jié)(筍衣開始脫落，莖稈呈現(xiàn)綠色)為莖稈中部，13節(jié)以上(筍衣包裹完好，莖稈為黃色)為莖稈頂部，取莖稈外層表皮，厚度為＜3 mm。6月初，選擇枝條梢部下3～4位無病斑的當年生葉片，取樣時間為10: 00?12: 00。取樣后直接進行發(fā)射熒光的測定；用于光合色素和電泳樣品取下后，迅速將樣品放進液氮中冷凍，存于?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 色素測定 采用ARNON[23]的方法略做修改。稱取毛竹葉片和莖稈0.5 g，剪碎后置于帶蓋的試管中，加體積分數(shù)為80%丙酮溶液5 mL，在暗處浸提48 h，分別在470、645和663 nm處測定其光密度D(λ)，參考LICHTENTHALER[24]的方法，計算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)質量分數(shù)。選取5株筍竹和5株成竹，每株作為1個獨立實驗，共5次重復。

1.2.2 77 K低溫熒光發(fā)射光譜測定 利用AvaSpec-HS-TEC超高靈敏型光纖光譜儀(北京愛萬提斯科技有限公司)，在液氮(77 K)中測量活體狀態(tài)下毛竹葉片和莖稈熒光發(fā)射光譜。采用陳登舉等[25]方法稍作修改，以AvaLight-LED 為激發(fā)光源(480 nm)，光照強度控制在3 000 μmol·m?2·s?1，發(fā)射波長范圍為600～900 nm，發(fā)射步長為1 nm，掃描速度為500 nm·s?1。測量前先用標準白板校對調0，每個樣品選擇無病斑毛竹葉片和各部位莖稈材料各20片，每片采集數(shù)據(jù)1次。

1.2.3 類囊體膜的提取 采用SCH?GGER等[26]方法稍作修改。稱取毛竹葉片10 g和筍竹莖稈50 g，加入 100 mL 預冷的提取液 (0.1 mol·L?1蔗糖，0.2 mol·L?1氯化鈉，50 mmol·L?1pH 7.4 磷酸緩沖液，質量濃度為2.5%聚乙二醇6000)中，用50 g多功能粉碎機(上海市蒲恒信息科技有限公司)粉碎至勻漿中無明顯碎片為止(大約1 min)，將勻漿通過4層過濾，濾液3 000×g離心10 min (4 ℃)，收集沉淀。將沉淀用10倍體積預冷后的清洗液(不含聚乙二醇的提取液)懸浮起來，3 000×g離心10 min (4 ℃)，收集沉淀。再用5倍體積的冷清洗液將沉淀懸浮起來，500×g離心5 min，棄沉淀，將上層懸液3 000×g離心10 min (4 ℃)，收集沉淀，并用懸浮液 (0.3 mol·L?1蔗糖，50 mmol·L?1氯化鈉，50 mmol·L?1磷酸緩沖液，pH 6.9)懸浮。得到的懸液即為類囊體膜蛋白制備液，測定葉綠素質量分數(shù)后儲藏于?20 ℃冰箱中。

1.2.4 BN-PAGE電泳 電泳樣品制備：取類囊體膜蛋白制備液1 000 μL (約含10 000 μg蛋白和1 000 μg葉綠素)，3 000×g離心 10 min(4 ℃)，取沉淀，用 1 000 μL 上樣緩沖液[ACA 緩沖液：750 mmol·L?1氨基己酸，50 mmol·L?1pH 7.0 雙 (2-羥乙基)氨基 (三羥甲基)甲烷 (Bis-Tris)，0.5 mmol·L?1乙二胺四乙酸(EDTA)]懸浮，再加入0.05 g毛地黃皂苷，混勻使之完全溶解，在冰浴中用JY88-IIN超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)處理混合液1 min，4 ℃下放置30 min，然后8 780×g離心30 min，取上清液，加入5 μL考馬斯亮藍染液(質量濃度為5%考馬斯亮藍G250，750 mmol·L?1氨基己酸)，混勻后上樣。第1向電泳：膠體由質量濃度為4%濃縮膠和5%～13%梯度分離膠組成，上樣量為30 μL。加入陽極緩沖液 (50 mmol·L?1Bis-Tris-HCl，pH 7.0)和陰極緩沖液 A [15 mmol·L?1Bis-Tris，50 mmol·L?1N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)，質量濃度為0.02%考馬斯亮藍G250]，80 V恒壓電泳，當樣品完全進入濃縮膠后，吸出陰極緩沖液A，換陰極緩沖液B (15 mmol·L?1Bis-Tris，50 mmol·L?1Tricine)，120 V恒壓直到電泳完成。整個電泳過程在4 ℃下完成。第2向電泳：將經(jīng)藍綠溫和膠分離的類囊體膜蛋白復合物膠條切下，在室溫下經(jīng)樣品處理液(質量分數(shù)為5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，體積分數(shù)為20%甘油，體積分數(shù)為10%巰基乙醇，50 mmol·L?1Tris-HCl，pH 6.8)處理30 min后，置于50 ℃水浴鍋中加熱5 min，然后用去離子水洗去巰基乙醇。把膠條放置在準備好的第2向膠體上，進行第2向電泳。電泳在室溫條件下進行，25 mA 恒流，陰極緩沖液：100 mmol·L?1Tris-HCl，100 mmol·L?1Tricine，質量濃度為 0.1% SDS，pH 8.25，陽極緩沖液：100 mmol·L?1Tris-HCl，pH 8.9。

1.3 數(shù)據(jù)處理

熒光光譜采集得到的數(shù)據(jù)經(jīng)Multispec 5.1初步處理，用Origin 9統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，經(jīng)卷積平滑消除噪音后，經(jīng)歸一處理，采用高斯函數(shù)對熒光發(fā)射光譜進行擬合，肩峰數(shù)目和峰位置通過四階導數(shù)光譜確認，多次擬合使殘差最小。所有數(shù)據(jù)均為5次重復的平均值±標準誤差。利用Origin 9進行統(tǒng)計分析和作圖，統(tǒng)計方法采用One-way ANOVA，進行Turkey多重比較(P＜0.01)。

2 結果與討論

2.1 光合色素質量分數(shù)

毛竹葉片和莖稈之間光合色素存在極顯著差異(表1)，在莖稈頂部，葉綠素和類胡蘿卜素的質量分數(shù)最低，比葉片分別低了93.4%和96.3% (P＜0.01)。隨著莖稈的發(fā)育成熟，葉綠素和類胡蘿卜素開始大量累積，在莖稈基部達到最高，比葉片分別低了30.6%和47.6%(P＜0.01)。莖稈葉綠素a/b均比葉片小，在莖稈成熟過程中，葉綠素a/b逐漸升高。莖稈基部和中部葉綠素a/b與葉片之間無顯著差異，莖稈頂部葉綠素a/b比葉片高46.5% (P＜0.01)。

表1 毛竹葉和莖稈的光合色素質量分數(shù)Table 1 Pigment content in leaves and stems of Ph. edulis

2.2 凝膠電泳結果

采用非變性BN-PAGE電泳技術分析了毛竹葉片和莖稈類囊體膜蛋白復合物(圖1)。毛竹葉片BN凝膠中蛋白復合物包括2種LHCⅡ-PSⅡ超復合物、約600 kDa的PSⅡ核心二聚體和PSⅠ、不同分子量的ATP合酶(ATP-synthase)組件、約290 kDa的PSⅡ核心單體、缺少CP43亞基的PSⅡ核心單體、約140 kDa的游離LHCⅡ三聚體和游離LHCⅡ單體。通過對比葉片類囊體膜蛋白復合物，莖稈BN凝膠中明顯的條帶有LHCⅡ-PSⅡ超復合物、PSⅡ核心二聚體幾乎與PSⅠ相連、ATP合酶、PSⅡ核心單體和LHCⅡ單體。在葉片BN凝膠中，最豐富的捕光色素蛋白復合物是LHCⅡ三聚體；而在莖稈BN凝膠中，最多的則是LHCⅡ單體。莖稈基部PSⅡ單體和二聚體與葉片相似，而缺少CP43亞基的PSⅡ單體的顏色明顯比葉片淡。隨著莖稈的成熟，PSⅡ單體和二聚體越顯著。

圖1 毛竹類囊體膜蛋白BN-PAGE電泳圖Figure 1 Blue-native gel electrophoresis analysis of Ph. edulis thylakoid membrane protein complexes

為了更好地比較兩者差異，將第1向分離的膠條切下，進行第2向Tricine-SDS-PAGE電泳。BNPAGE第1向電泳分離了類囊體膜大分子蛋白復合物，經(jīng)第2向電泳分離得到各小亞基(圖2)，參考RANTALA等[27]的研究結果，比較光系統(tǒng)發(fā)育情況。經(jīng)過考馬斯亮藍染液的染色補充，顯示了與CP47、CP43、D2、D1和LHCⅡ亞基對應的位置。蛋白復合物對應于：LHCⅡ-PSⅡ超復合物、PSⅡ核心二聚體、PSⅡ核心單體、LHCⅡ三聚體和LHCⅡ單體。ATP合酶在第2向電泳中分離得到57 kDa的ATPα和55 kDa的ATPβ。毛竹葉片和莖稈基部PSⅠ經(jīng)第2向電泳分離得到PsaA/B和PsaD，莖稈中部得到PsaA/B，但在莖稈頂部的膠體中沒有明顯地顯示出PsaA/B。

2.3 77 K低溫熒光發(fā)射光譜

如圖3A所示：以毛竹葉片光譜為參考，毛竹葉片77 K熒光發(fā)射光譜呈典型的M型，分別對應于PSⅡ(685 nm)和PSⅠ(745 nm)。莖稈熒光發(fā)射光譜被歸一化為最大值，以便于莖稈相互之間的比較以及與毛竹葉片的比較。莖稈基部光譜與毛竹葉片的基本一致，莖稈中部在685 nm對應PSⅡ，熒光強度比毛竹葉片高；在745 nm對應PSⅠ，熒光強度最低。莖稈頂部在680 nm處出現(xiàn)藍移現(xiàn)象。此外，熒光強度與莖稈中部一致；在745 nm處熒光強度比毛竹葉片低且主峰不明顯。

圖2 類囊體膜蛋白復合物第2向電泳Figure 2 Two-dimension Tricine-SDS-PAGE results of protein complex in thylakoid membranes in Ph. edulis

對毛竹葉片和莖稈的77 K熒光發(fā)射光譜進行四階導數(shù)處理(圖3B)。紅光區(qū)毛竹葉片與莖稈基部以及中部的四階導數(shù)光譜基本一致，主峰均在685 nm處，各有1個肩峰均在653 nm處；莖稈頂部的四階導數(shù)光譜出現(xiàn)明顯的藍移現(xiàn)象。主峰在680 nm處，在650 和710 nm處有2個肩峰。毛竹葉片和莖稈的四階導數(shù)光譜在遠紅光區(qū)差異很大，毛竹葉片和莖稈基部及中部主峰在745 nm處，在725和765 nm處有2個肩峰；莖稈頂部的主峰在741 nm處，在725 和750 nm處有2個肩峰。

圖3 毛竹葉和莖稈的77 K熒光發(fā)射光譜和四階導數(shù)光譜Figure 3 77 K fluorescence emission spectrum and fourth-derivative spectrum from leaves and stems of Ph. edulis

在77 K熒光發(fā)射光譜范圍內，通過高斯函數(shù)解析出2個高斯光譜組分(表2，圖4)。在紅光區(qū)，毛竹葉片和莖稈的熒光峰都在685 nm左右；在遠紅光區(qū)，毛竹葉片和中下部莖稈的熒光峰在740 nm左右，但莖稈頂部熒光峰在756 nm處，出現(xiàn)明顯紅移。基部和頂部的2個解析峰面積比(A1/A2)、峰高比值(H1/H2)和2個熒光峰的半峰寬比(W1/W2)分別比毛竹葉片低46.7%和9.9%、30.8%和41.1%、22.1%和35.6% (P＜0.01)；中部的A1/A2、H1/H2、W1/W2分別比毛竹葉片高191.1%、40.4%和109.3% (P＜0.01)。

表2 毛竹葉和莖稈的77 K熒光發(fā)射光譜高斯解析結果Table 2 Results of Gaussian decomposition of 77 K fluorescence spectra for leaves and stems of Ph. edulis

圖4 毛竹葉和莖稈的77 K熒光發(fā)射光譜的高斯擬合Figure 4 77 K fluorescence emission spectra and results of Gaussian fitness for leaves and stems of Ph. edulis

3 討論

光在植物生長中具有特殊作用，除了作為一種能源控制著光合作用，還作為一種觸發(fā)信號影響著植物生長[28]。ALEXANDER等[29]研究發(fā)現(xiàn)：樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica針葉和樹皮中葉綠素a/b和類胡蘿卜素組成相似。本研究結果顯示：莖稈受到光照后，色素大量形成。莖稈基部和中部葉綠素a/b相似，但莖稈頂部葉綠素a/b顯著高于毛竹葉片。這可能因為中上部有筍衣包裹，受到光照強度隨著莖稈節(jié)間的升高而減弱，為了適應這種環(huán)境，莖稈葉綠體中會有較高的葉綠素a/b。

在芒果Mangifera indica等綠色肉質水果中，PSⅡ的效率普遍較高，與葉片的效率相當[30?31]。FERRONI等[32]研究發(fā)現(xiàn)，成熟果實中CP43-less PSⅡ核心單體含量比葉片高，成熟果實中LHCⅡ-PSⅡ超復合物的含量比葉片低。BONORA等[33]發(fā)現(xiàn)類囊體在成熟早期發(fā)生，隨后在成熟后期大量積累類胡蘿卜素。PSⅡ反應中心由蛋白D1和D2組成[34]，兩側是內周捕光天線蛋白CP47和CP43[35]，大多數(shù)與PSⅡ相關的葉綠素都存在于外周捕光天線(LHCⅡ)復合體中[36]。BARSAND等[37]發(fā)現(xiàn)番茄Solanum lycopersicon葉綠體向色質的轉變與光系統(tǒng)發(fā)生機制的破壞(囊泡運輸、為類囊體生物合成提供材料、光系統(tǒng)組裝)是一致的，會導致光反應蛋白的減少。毛竹葉片PSⅡ經(jīng)分離得到了反應中心蛋白D2、D1、內周天線蛋白CP47、CP43以及大量外周捕光天線蛋白，葉片PSⅡ發(fā)育完全；莖稈PSⅡ經(jīng)分離也得到了D2、D1、CP47、CP43蛋白，但外周捕光天線蛋白明顯比葉片少，從莖稈基部到頂部外周捕光天線蛋白數(shù)量顯著減少。表明毛竹莖稈中PSⅡ核心復合物已形成，隨著莖稈發(fā)育，筍衣逐漸脫落，莖稈受到光照加強，色素大量形成，捕光天線蛋白逐漸增多，使得PSⅡ復合體發(fā)育更完整。

SMART等[38]發(fā)現(xiàn)：psaA或psaB基因失活都將導致PSⅠ復合物在類囊體中缺失，表明PsaA或PsaB不能單獨形成二聚體，而PsaA/B異二聚體的存在是整個PSⅠ復合物組裝所必需的。PSⅠ的外周蛋白PsaD和PsaE位于類囊體基質側形成一個凸點。有研究[39]顯示：PsaD、PsaE和Fd之間有互作關系，普遍認為PsaD通過與帶負電荷Fd之間的靜電互作而為Fd提供必要的結合位點，同時PsaD也是PSⅠ中PsaC和PsaE正確組裝所必需的。毛竹葉片PSⅠ經(jīng)分離得到了PsaA/B和PsaD小亞基，葉片PSⅠ已發(fā)育完全；莖稈基部發(fā)現(xiàn)了PsaA/B和PsaD亞基，PSⅠ核心復合物已形成，小亞基正在整合到PSⅠ核心復合物上；莖稈中部發(fā)現(xiàn)PsaA/B，但未發(fā)現(xiàn)其他小亞基，這可能是因為莖稈中部PSⅠ核心復合物在組裝過程中，小亞基都呈現(xiàn)游離狀態(tài)，在提取類囊體膜蛋白復合物時，這些小亞基未能夠完整提取；莖稈頂部未發(fā)現(xiàn)PsaA/B和小亞基，PSⅠ核心復合物還未組裝。這表明莖稈PSⅠ的發(fā)育是從基部開始的，隨著筍衣脫落，裸露的莖稈受到光照，色素大量形成，PSⅠ核心復合物開始組裝完整。

植物葉綠體內不同的色素蛋白復合物發(fā)射的熒光構成了葉綠體的熒光發(fā)射光譜[40]，而這些蛋白復合物具有不同的發(fā)射熒光峰位[41]。莖稈基部在紅光區(qū)的77 K熒光發(fā)射光譜與毛竹葉片基本一致，這說明光照不足對毛竹葉片與成熟莖稈PSⅡ核心復合物的組成無顯著影響。紅光區(qū)內的肩峰主要是CP47、CP43和LHCⅡ引起的[42]；遠紅光區(qū)附近的肩峰是由PSⅠ反應中心和LHCⅠ引起的[43]。在紅光區(qū)內莖稈頂部的最大峰出現(xiàn)了藍移現(xiàn)象，這可能是由于莖稈頂部被筍衣包裹，光照不足會導致CP47等亞基含量減少[44]；也可能是因為PSⅡ中的CP47、D1、D2等色素蛋白的二級結構以及色素分子的空間位置發(fā)生了改變，導致藍移現(xiàn)象[45]。毛竹葉片的葉綠素a和類胡蘿卜素遠遠高于莖稈，而毛竹葉片熒光強度比莖稈低。這可能是因為PSⅡ核心復合物只結合有葉綠素a和β-胡蘿卜素(β-Car)，當激發(fā)光激發(fā)PSⅡ核心復合物時，穩(wěn)態(tài)發(fā)射光譜顯示隨著β-胡蘿卜素分子吸收強度的增加，向葉綠素a分子進行能量傳遞的熒光耗散就越少，其發(fā)射熒光強度就降低[13]。遠紅光區(qū)內的光譜特征可能只由于毛竹葉片和莖稈基部葉綠體中的PSⅠ核心復合物基本都已形成，但莖稈中部和頂部 PSⅠ核心復合物還未完全形成，還有較多的的LHCⅠ和PSⅠ-LHCⅠ，所以光譜中出現(xiàn)肩峰。

綜上所述，在毛竹莖稈成熟早期，PSⅡ核心復合體已形成，隨著莖稈發(fā)育，筍衣逐漸脫落，色素大量合成，內周天線蛋白CP47和CP43以及外周捕光天線蛋白逐漸形成，PSⅡ的77 K發(fā)射光譜熒光強度逐漸減小；同時，莖稈受到光照后PSⅠ核心蛋白PsaA和PsaB開始形成，逐漸組裝合成PSⅠ核心復合體，PSⅠ的77 K發(fā)射峰熒光強度逐漸增大。