羅伊氏乳桿菌對腸道環境影響的實驗教學探索

蔣 敏， 李 恒， 李 會， 史勁松

（江南大學藥學院，江蘇無錫214000）

0 引 言

微生物實驗是我院制藥工程專業本科教學的核心基礎課程之一，在本專業技能培養中具有極其重要的意義［1］。目前，開設的常規基礎實驗可以有效地保證學生掌握微生物學基本實驗技能，但要培養出雙“一流”高校人才，還需注重培養學習興趣和創新思維，重點提升分析解決問題的綜合能力，因此有必要緊密結合前沿性科研成果，圍繞微生物基本實驗核心點，輻射發散至藥理學、藥物分析等多個實驗方向，對實驗教學內容進行擴充，形成輻射狀的綜合性教學模式，提升本科教學實驗的縱橫向飽滿度。

隨著分子生物學、腸道微生學等學科的迅速發展，腸道微生態與機體健康的研究也已經普及到食品［2］、化工［3］、醫藥［4］等多個領域，其作用也日益受到人們的關注與重視［5］，可以認為研究微生物／微生物群與其宿主的關系已成為現代應用微生物學的重要發展方向之一。因此開設圍繞“健康”為主旨的微生物學綜合實驗在制藥工程專業教學工作中具有一定的意義。

本綜合性實驗依托于學院腸道微生態的研究成果［6-12］，以一株前期分離得到的安全有效的益生菌［13-14］—羅伊氏乳桿菌為研究對象，由學生進行菌株觀察與鑒定，應用腸道厭氧發酵模擬器-氣相色譜對該菌株腸道“益生”作用進行定量評價，在小鼠腸道菌群失調模型上進行宏觀考察。通過開設此綜合性實驗，不僅可以促進學生鞏固經典微生物基本操作，掌握分子生物學、藥物分析、藥理學實驗技能，還可提高學生創新思維和科研熱情。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

MRS培養基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.25 g（MnSO4·H2O 0.19 g），MgSO4·7H2O 0.58 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

發酵培養基（g／L）：KMOS 8.0、胰蛋白胨3.0、蛋白胨3.0、酵母提取物4.5、膽鹽3 號0.4、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8、氯化鐵血紅素0.05、NaCl 4.5、KCl 2.5、MgCl2·6H2O 0.45、CaCl2·6H2O 0.2、KH2PO40.4、Tween80 1.0、微量元素（MgSO4·7H2O 3.0、MnCl2·4H2O 0.32、FeSO4·7H2O 0.1、CoSO4·7H2O 0.18、CaCl2·2H2O 0.1、ZnSO4·7H2O 0.18、CuSO4·5H2O 0.01、NiCl2·6H2O 0.092）2.0，pH 6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。

10名健康志愿者糞便；羅伊氏乳桿菌為本實驗室保存菌株；本實驗中使用的細菌基因組提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒等均購上海生工；PCR過程中所用引物購于上海生工，PCR過程中所用酶及試劑均購自索萊寶生物；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸（GC，純度≥99.5%）購自阿拉丁試劑有限公司；其他試劑：分析純，上海國藥集團。

1.2 實驗儀器

顯微鏡；酶標儀；PCR擴增儀；低速離心機；厭氧工作站（37℃，80% 二氧化碳，10% 氫氣，10% 氮氣）；酸度計；渦旋儀；高壓蒸汽滅菌鍋；金屬??；氣相色譜儀；切片機；pH自動控制加液機。

1.3 實驗動物

BALB／c小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，飼養溫度（23±2）℃，相對濕度（50±5）%，自由進食和飲水，適應性飼養1周。

2 實驗方法

2.1 菌株的生理生化鑒定

菌株活化后接入MRS培養基，37℃靜置培養24 h，取少量菌液并適當稀釋，涂布MRS平板，37℃厭氧培養48 h，于顯微鏡下觀察細胞形態、生理生化鑒定。

2.2 16 S rDNA序列分析

用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細菌通用引物進行16 S rDNA的PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ExTaq 酶0.25 μL，ddH2O 18.25 μL。PCR 反應條件：95 ℃ 預變性，2 min；循環過程為95℃變45 s，退火溫度56℃，45 s，72℃延伸90 s，共進行30個循環；72℃終延伸10 min，4℃保持，共30個循環。PCR產物經電泳后回收純化，送上海生工有限公司測序，測序結果在GenBank中進行BLAST比對，確定種屬類別。

2.3 體外評價

2.3.1 腸道發酵器的搭建與穩定性評價

文獻［15］方法：結合實際研究搭建模擬腸道發酵器（見圖1），按照配方配置發酵培養基，高溫滅菌后向系統中通入高純氮氣，控制系統的溫度、攪拌速度、pH等，使其保持穩定。取新鮮的健康捐獻者的糞便樣品5 g，滅菌PBS制成20%（w／v）菌懸液，震蕩混勻，離心（8 000 r／min，1 min）取上清，將上清液通過補料口接種到已經預運行48 h的發酵罐中，調節蠕動泵以輸送新鮮培養基和廢液，使發酵罐的液位恒定。PCRDGGE檢測證明連續發酵的前期（0～8 d），系統中菌群波動較大，處于不穩定狀態，當發酵進入第9、10 d后，DGGE圖譜上條帶相似度高，種類及豐富度基本沒有變化，說明此時發酵器內的菌群處于穩定狀態，UPGMA相似性聚類分析結果基本與DGGE結果一致。因此，本實驗選擇經發酵器連續厭氧發酵10 d后的穩定的腸道微生物群落為研究對象，研究羅伊氏乳桿菌的腸道調節作用。

2.3.2 實驗組設計

以穩定恒化器中的腸道微生物菌群作為發酵系統，設置兩組實驗：對照組與羅伊氏乳桿菌組（接種量為1%），厭氧條件下連續培養36 h，取樣檢測。

2.3.3 SCFA 檢測

圖1 模擬腸道發酵器

文獻［16-17］方法：取1 mL培養液，4℃，12 000 r／min下離心10 min除菌體。取500 μL上清，離心去除沉淀，加入1 mL乙醚萃取15 min，低溫離心分離，取上清進樣。精密稱取乙酸、丙酸、丁酸、戊酸適量，加乙醚制成儲備液，加入內標物（50 μg／mL），待進樣。以標準物和內標物濃度比為橫坐標，對應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，用于計算待測物濃度。采用氣相色譜法檢測短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）含量，色譜柱：DB-WAX 30M（I.D.0.32 mm，5 μm）；升溫程序：50℃保持3 min，以6℃／min升至120℃，保持0.5 min，以6℃／min升至220℃，保持5 min；載氣（N2）流速3 mL／min，載氣（H2）流速47 mL／min；空氣流量400 mL／min；進樣量1.0 μL；分流比1∶3。數據采用Origin 8軟件作圖，結果以平均值±標準差（mean±SD）表示。

2.4 樣品處理

2.4.1 實驗動物模型

1周的適應期后，小鼠隨機分成3組，每組8只，取兩組小鼠，連續7 d灌胃頭孢曲松鈉生理鹽水溶液（1.25 mg／g bw）造模。將模型小鼠平均分為模型組和羅伊氏乳桿菌組兩組，其中羅伊氏乳桿菌組連續15 d灌胃羅伊氏乳桿菌菌液（濃度為0.5×1010CFU／g bw）。模型組和對照組連續15 d灌胃等體積生理鹽水。

2.4.2 實驗動物及樣品處理方法

實驗定期進行稱重并監測小鼠的攝食量，飲水量，記錄數據，灌胃結束后將小鼠頸椎脫位處死，腹部75%乙醇消毒，解剖，取盲腸內容物測定SCFA，盲腸內容物取出后，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，75%乙醇脫水、石蠟包埋、切片、染色，顯微鏡下觀察。

3 實驗結果

3.1 菌株鑒定結果

顯微鏡下菌落為乳白色，不透明，濕潤，中心不凸起，屬于細菌。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對菌株分別進行生理生化鑒定，結果如表1所示。進一步分析生理生化鑒定結果可知，該菌株均能利用糖類物質生長，同時產酸，且大部分菌株對膽鹽的耐受能力較強。以菌株的基因組為模板，PCR擴增長度為1.5 kb，該片段提交至GenBank中，與已報道的序列進行BLAST比對，比對結果最終確定本實驗的試驗菌為羅伊氏乳桿菌。

表1 菌株生理生化特征

3.2 體外腸道發酵器評價

SCFA是含1～6個碳原子的有機羧酸，是目前最常用的腸道微生態研究指標之一，其主要包含乙酸、丙酸、丁酸和戊酸［18］?，F代藥理學與臨床研究表明，SCFA參與腸上皮細胞的能量供應，不僅可影響腸腔pH和電解質平衡、腸黏膜屏障的通透性、腸道高敏感和腸動力的調節，還與抗炎、抗腫瘤等密切相關。已有研究表明，不同種類SCFA的生理功能各有特點，如丁酸為腸道上皮細胞的主要能量來源，可通過激活氯離子／丁酸通道、促進鈉離子／氫離子交換等途徑促進腸道水與離子的吸收，改善腹瀉情況［19-20］，此外，丁酸還可通過抑制組蛋白去乙?；?，抑制端粒酶活動，發揮抗腫瘤效應［21］；丙酸有助于保護腸黏膜屏障，通過STAT3信號通路減少炎癥與氧化損傷［22］等。

不同組SCFA檢測結果如表2所示。數據可見，外源添加羅伊氏乳桿菌對腸道SCFA產生的種類沒有影響，但對含量有顯著影響。相較于對照組，添加了羅伊氏乳桿菌后，丙酸、丁酸、戊酸含量分別顯著增加了25.9、3及9倍，而乙酸未發生顯著變化。體外實驗結果表明，羅伊氏乳桿菌可影響腸道SCFA結構，從而發揮益生作用。

3.3 菌群失調模型建立及評價

3.3.1 體重檢測結果

實驗期間無小鼠死亡，各組小鼠飲水量與采食量無顯著差異。對照組小鼠體重在實驗期間無顯著變化，而模型組和羅伊氏乳桿菌組小鼠在造模后體重均有所下降，經過15 d灌胃處理后兩組體重均有所回升，但與對照組無顯著差異。

表2 不同組SCFA的產生量

3.3.2 SCFA 檢測結果

不同組小鼠腸道內SCFA含量檢測結果如表3所示。數據可見，模型組小鼠腸道內SCFA含量顯著降低，其中總酸含量從（68.15 ± 6.5）mmol／L 下降至（16.27 ±0.79）mmol／L，其中乙酸含量從（32.56 ±2.32）mmol／L 顯著下降至（12.02 ±0.42）mmol／L，丁酸含量從（27.15 ±4.98）mmol／L 顯著下降至（4.25 ±1.22）mmol／L，而丙酸與戊酸幾乎檢測不出。而與模型組相比，羅伊氏乳桿菌組小鼠腸道內總酸含量［（98.55 ±3.23）mmol／L］顯著高于模型組［（16.27 ±0.79）mmol／L］，其中乙酸、丁酸、戊酸分別為（35.93±0.99），（26.07 ±4.08），（0.49 ± 0.10）mmol／L，與對照組無顯著差異；與體外結果相一致的是丙酸含量增加最明顯，為（36.05 ±4.41）mmol／L，顯著高于對照組。分析可見，抗生素干擾小鼠腸道菌群平衡，造成了SCFA顯著下降，而羅伊氏乳桿菌能夠顯著改善腸道環境，提高SCA的產量，但體內與體外的SCFA趨勢結果不完全一致，這可能是由于體外只能實現小部分腸道微生物的培養，導致了體內外微生物菌群的差異。

表3 盲腸內容物SCFA含量 mmol／L

3.3.3 腸道組織形態觀察

圖2所示為隨機抽取的盲腸組織切片光鏡圖，由圖可見，對照組小鼠腸道上皮細胞完整，絨毛排列整齊，模型組腸上皮細胞破壞嚴重，腸絨毛缺損明顯，排列紊亂，而經過羅伊氏乳桿菌干擾的小鼠腸上皮結構與對照組相近，腸絨毛排列整齊且致密。

圖2 小鼠盲腸縱切面200×

表4所示為各組腸絨毛高度，數據顯示模型組小鼠腸絨毛高度［（76.4 ±7.5）μm］相較于對照組［（149.7 ±4.5）μm］顯著降低（P ＜0.05），經過羅伊氏乳桿菌干預的小鼠腸絨毛高度［（165.9±5.1）μm］較模型組甚至空白對照組都有顯著增長（P＜0.05）。結果表明，羅伊氏乳桿菌能夠在抗生素失調模型小鼠中發揮腸道保護作用。這可能是由于羅伊氏乳桿菌能夠通過調節腸道SCFA的數量與結構，改善抗生素引起的腸黏膜損傷，促進腸絨毛的增長等［23］。

表4 各組小鼠盲腸絨毛高度

4 結 語

（1）菌株的培養鑒定實驗可進一步鞏固學生微生物的基本操作技能，在此基礎上增加了常規的分子操作，拓寬了傳統微生物實驗課的視野，為學生進一步從事相關科研工作奠定了基礎。

（2）以SCFA為定量指標，搭建了體外腸道模擬發酵器，提高微生物實驗課堂的趣味性，該實驗單元著重培養了學生對氣相色譜、PCR等科研型儀器的操作能力。

（3）藥理學技術等已在多學科領域得到全面普及，動物實驗單元要求學生熟練掌握解剖、取樣等技能以獲取樣本，進行關鍵性指標檢測及常規病理切片，對培養學生綜合實驗技能和提高科研素養具有重要的意義。

（4）通過本實驗項目的實施，有助于學生掌握精準化腸道微生態營養產品的開發與研究的一般方法與科研思路，為未來從事藥學、食品、微生物學等領域相關工作奠定基礎。