豆漿成分對Bowman-Birk 胰蛋白酶抑制劑熱失活程度的影響

甄少波，王建設，何 輝，劉奕忍，陳業明,*

（1.中國勞動關系學院，北京 100048；2.中儲糧油脂有限公司，北京 100043；3.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；4.北京市理化分析測試中心，北京 100094）

豆漿中的Bowman-Birk胰蛋白酶抑制劑（Bowman-Birk inhibitor，BBI）是一種熱穩定性極高的雙頭抑制劑，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[1-2]。在100 ℃、15 min的條件下，豆漿中的Kunitz胰蛋白酶抑制劑（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）幾乎全部失活，但只有不到5%的BBI失活[3]。研究表明：KTI和BBI分別貢獻豆漿中約75%和25%的胰蛋白酶抑制活性（trypsin inhibitor activity，TIA）[4-5]。有報道指出，TIA降低90%后，也就是大約60%的BBI失活后，豆漿具有最高的營養價值[6-7]。

20世紀80年代開始，有很多研究表明，BBI濃縮物（BBI純度70%以上）具有抗癌的效果[8]，尤其是結腸癌[9]、乳腺癌[10]和前列腺癌[11]。1992年，美國食品藥品監督管理局批準了大豆BBI濃縮物可用于臨床研究。臨床研究發現，BBI濃縮物對于口腔白斑病、潰瘍性結腸炎和良性前列腺增生具有較好的效果[12-17]。但在臨床研究中，BBI的最大劑量為800 U/（d·人），相當于3.86 mg活性BBI[12]。在此劑量下，BBI不會對人體產生副作用。按照BBI占大豆總體蛋白的1%，豆漿蛋白質量分數為2.4%計算，100 mL未加熱豆漿中含有24 mg BBI，該含量遠大于推薦劑量。這說明在保證人體安全的條件下，應該破壞BBI活性。這也側面解釋了中國的傳統豆腐工藝要進行壓制去黃漿水的原因（含有許多活性BBI）。

隨著研究深入，有研究者提出BBI濃縮物中具有抗癌效果的并不是BBI，而是伴隨蛋白成分lunasin[18-20]。在進入消化系統后，BBI起到保護lunasin不受胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的作用。不過也有研究者提出BBI能夠抑制體內變異的絲氨酸蛋白酶[21]，從而抑制癌癥發展。

基于上述研究結果，對BBI進行一定程度的熱失活是必要的。文獻報道BBI熱失活原因可歸結為以下3大類：1）熱誘導BBI構象變化[22]；2）BBI與大豆蛋白的相互作用（巰基/二硫鍵交換反應和蛋白質聚集體形成）[23]；3）與還原糖（如葡萄糖和果糖）發生美拉德反應[24]。然而，目前還沒有文獻報道上述3大類原因對于BBI熱失活的貢獻程度。本研究通過建立模型體系研究豆漿成分中的還原糖和大豆蛋白對BBI活性的影響，并分析BBI熱失活的貢獻程度，旨在為通過添加還原糖和調節豆漿蛋白含量調控胰蛋白酶抑制活性和指導豆制品生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機大豆，產地黑龍江，2015年收獲，購于優谷坊。

鹽酸、95%乙醇溶液、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、硫酸銨、甲醇、氯化鈉、冰乙酸、二水氯化鈣、二甲亞砜、丙酮、考馬斯亮藍G-250、甘油、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、溴酚藍國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白酶 美國Worthington公司；α-胰凝乳蛋白酶、N-苯甲酰-L-酪氨酸酰對硝基苯胺（N-benzoyl-L-tyrosine p-nitroanilide，BTpNA）、丙烯酰胺、N,N,-甲叉雙丙烯酰胺、N-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯酰胺鹽酸鹽（N-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride，BAPA））、N-三(羥甲基)甲基（Tricine）、ι-卡拉膠（ι-carrageenan，ι-CG）美國Sigma-Aldrich公司；精確分子質量雙色預染蛋白標準品 美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設備

MOS-450圓二色譜儀 法國BioLogic公司；Gel Doc-It TS凝膠成像儀 美國UVP公司；電腦恒溫層析柜上海滬西分析儀器廠；CR 21G II型冷凍離心機 日本Hitachi公司；UV-1500紫外-可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；基質輔助激光解析飛行時間質譜儀德國Bruker Daltonics公司；DYY-8C型垂直電泳儀北京六一儀器廠；1100液相色譜儀 美國安捷倫公司；等電聚焦儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 BBI的分離

按照He Hui等[22]的方法進行制備。稱量100 g黃豆于4 ℃浸泡18 h，加水至1 000 g，磨漿1 min。4 層紗布過濾除去豆渣，調節豆漿pH 4.5，10 000×g離心30 min，收集上清液。加入硫酸銨至40%飽和度，15 000×g離心30 min，收集沉淀并溶解于去離子水中，調節pH 7.0。采用截留分子質量3 500 Da的透析袋于4 ℃透析48 h。稀釋透析完蛋白質溶液質量濃度（BCA方法測定）至0.4 g/100 mL，并調節pH 7.0。同時準備0.4 g/100 mL的ι-CG溶液。按照蛋白與多糖質量比5∶1，將以上蛋白溶液和多糖溶液混合均勻，調節pH 3.85；5 000×g離心20 min，收集上清液。將上清液用1.0 mol/L NaOH溶液調至pH 7.0，利用截留分子質量100 kDa的超濾裝置進行超濾去除卡拉膠，收集濾過液。將濾過液再次使用3 500 Da透析袋4 ℃透析48 h后，冷凍干燥，收集樣品，貯藏于－20 ℃備用。所得樣品的BBI純度超過70%[22]，以下稱其為BBI。

1.3.2 大豆蛋白制備

20 g大豆于4 ℃浸泡18 h，加去離子水至200 g，磨漿1 min，4 層紗布過濾除去豆渣。豆漿中加入20%的蔗糖，25 000×g高速離心30 min，得到上浮、清液和沉淀，利用注射器吸取清液。用2 mol/L鹽酸將清液pH值調至4.5，3 000×g離心5 min，得到清液和沉淀，倒去清液，加入300 g去離子水，攪拌均勻，調pH值至4.5，3 000×g離心5 min，得到清液和沉淀，倒去清液，加入300 g去離子水，攪拌均勻，調pH值調4.5，3 000×g離心5 min，得到清液和沉淀。以上過程是為了除去大豆清蛋白，尤其是其中的KTI和BBI，這是因為它們在pH 4.5時具有良好的水溶性[25]。向沉淀里加入20 g去離子水，攪拌均勻，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調pH 7.0，用3 500 Da透析袋4 ℃透析48 h后，冷凍干燥得到大豆蛋白樣品。

1.3.3 還原糖對BBI熱失活的影響

制備2 mg/mL的BBI溶液，稱取一定量的葡萄糖或果糖，添加至BBI溶液中，使溶液體系中的葡萄糖質量濃度為0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、1、2 mg/mL和3 mg/mL，或果糖質量濃度為2 mg/mL。混合均勻后，沸水浴加熱。

1.3.4 大豆蛋白對BBI熱失活的影響

制備質量濃度均為4 mg/mL的BBI和大豆蛋白溶液，等體積混合均勻，沸水浴加熱。

1.3.5 TIA測定

參考Lu Lu等[26]的方法。對1.3.3節和1.3.4節的反應體系進行稀釋，使得稀釋后的1 mL樣品可以抑制40%～60%的胰蛋白酶。將1 mL稀釋樣品和1 mL去離子水加入到試管中5 min，加入5 mL的0.04 g/100 mL BAPA（pH 8.2 Tris-鹽酸緩沖液，0.02 mol/L CaCl2）為底物，再加入2 mL的0.012 g/100 mL胰蛋白酶（0.04 mmol/L鹽酸）。10 min之后，加入1 mL的體積分數30%乙酸溶液終止反應。混合均勻后，利用紫外分光光度計在410 nm波長處測定吸光度。試劑空白：按稀釋樣品、乙酸溶液、去離子水、胰蛋白酶溶液和BAPA順序加入試管；樣品空白：按去離子水、乙酸溶液、去離子水、胰蛋白酶溶液和BAPA順序加入試管。原始樣品需要稀釋至1 mL，稀釋樣品可以抑制40%～60%的胰蛋白酶。上述操作在37 ℃水浴中進行。

1.3.6 胰凝乳蛋白酶抑制活性（chymotrypsin inhibitor activity，CIA）測定

參考Lu Lu等[26]的方法。將1 mL稀釋樣品、1 mL去離子水和4.2 mL的0.05 mol/L Tris-鹽酸緩沖液（pH 8.2，0.01 mol/L CaCl2）加入到試管中。10 min后，加入2 mL的0.02%胰凝乳蛋白酶（溶于0.002 mol/L鹽酸），再加入0.04 g/100 mL BTpNA（溶于丙酮），混合均勻。10 min后，加入30%乙酸溶液終止反應。利用紫外分光光度計在385 nm波長處測定吸光度。試劑空白：按稀釋樣品、乙酸溶液、去離子水、Tris-鹽酸、胰蛋白酶溶液和BTpNA順序加入試管；樣品空白：按去離子水、乙酸溶液、去離子水、Tris-鹽酸、胰凝乳蛋白酶溶液和BTpNA順序加入試管。原始樣品需要稀釋到1 mL，稀釋樣品可以抑制30%～40%的胰凝乳蛋白酶。上述操作在37 ℃水浴中進行。

1.3.7 Tricine-SDS-PAGE分析

參考Schagger[27]的方法。2 mg/mL的蛋白樣品與等體積的樣品溶解液混合。10 μL加入電泳膠，在恒定電壓（30 mV）下直到所有樣品進入濃縮膠，再在恒定電壓（100 mV）下直到結束。

1.3.8 對角線電泳實驗

參考Zhao Luping等[28]的方法，按照1.3.7節方法進行第一向電泳實驗。結束后，將目標泳道切下，浸入體積分數2% β-ME溶液中。沸水浴5 min后，靜置在水浴中10 min（還原二硫鍵）。將還原后的膠條放置于電泳夾板中，灌入提前配好的分離膠溶液，使膠液沒過預先裝入的膠條，左右晃動，反復3 次后，水封，靜置等待分離膠凝固。注意灌入同時不要產生氣泡。凝固后，在恒定電壓（100 mV）下進行電泳測定。

1.3.9 圓二色譜測定

采用遠紫外光譜法分析樣品的二級結構，在室溫下進行實驗，對照為去離子水。石英比色皿厚度為0.2 cm，光譜分辨率為0.5 nm，比色皿厚度為1.0 nm，響應時間為0.125 s。掃描波長為190～250 nm，掃描速率為2 s/nm。重復掃描9 次后取平均值。

采用近紫外光譜法分析樣品的三級結構，對照為去離子水。石英比色皿厚度為1.0 cm，掃描波長為250～300 nm，掃描速率為2 s/nm。重復掃描9 次后取平均值。

1.4 數據分析及圖表繪制

每個樣品的TIA和CIA至少測定3 次取平均值，使用Microsoft Excel 2007軟件計算標準偏差。BBI條帶強度利用Image Lab Software（Bio-Rad，Hercules，CA）進行分析。利用Microsoft Excel 2007軟件繪制圖。

2 結果與分析

2.1 未加熱條件下還原糖對BBI活性影響

豆漿含有葡萄糖和果糖等還原糖，有研究報道美拉德反應的發生會影響BBI活性[24]。首先，考察在沒有加熱的情況下葡萄糖和果糖對BBI活性的影響（圖1a）。結果顯示，葡萄糖可以增強BBI的TIA和CIA，而果糖不影響BBI活性。該實驗重復3 次，顯示同樣的結果。因此，將BBI與不同比例的葡萄糖混合（圖1b），結果顯示：隨著葡萄糖質量濃度增大，TIA和CIA先增大后減小；當葡萄糖質量濃度達到0.3 mg/mL時，TIA最大；葡萄糖質量濃度達到0.5 mg/mL時，CIA最大。上述結果說明葡萄糖可以增強BBI和胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶之間的相互作用，而果糖不影響。對于該現象，利用圓二色譜考察葡萄糖對于BBI二級結構和三級結構的影響。

圖1 未加熱條件下還原糖對BBI（22 mmgg/mL）活性的影響Fig. 1 Effects of glucose and fructose on BBI activity without heating

圓二色譜（圖2）顯示，葡萄糖可輕微地改變BBI的空間構象。對BBI與葡萄糖混合后，樣品的TIA、CIA增大。推測此現象的可能原因是：高親水性的葡萄糖分子與BBI分子抑制中心的某些氨基酸殘基形成氫鍵，使得BBI分子抑制中心發生變化，從而導致其抑制劑活性增加。具體原因有待進一步研究。

2.2 加熱條件下還原糖對BBI活性的影響

圖3 沸水浴加熱條件下葡萄糖和果糖對BBI的TIAA（ aa）和CIA（b）殘留率的影響Fig. 3 Effects of glucose and fructose on the TIA (a) and CIA (b) of BBI in boiling water bath

圖3 a顯示：隨著加熱時間的延長，BBI單純體系和BBI+還原糖的TIA逐漸減小；熱處理0.5 h后，果糖+BBI與BBI單純體系中TIA殘留率相差不大，此后，兩類樣品的差距加大，差距保持在13%左右；熱處理3 h后，BBI單純體系的TIA殘留率最高（約81%），而葡萄糖+BBI和果糖+BBI的TIA殘留率分別約為58%和69%；葡萄糖+BBI的TIA一直保持著最快的下降速率，但下降速率逐漸趨于緩慢。圖3b顯示：還原糖對BBI的CIA影響不大，這與BBI的TIA和CIA活性中心的氨基酸殘基組成密切相關。TIA的活性中心包含一個賴氨酸殘基，可與還原糖發生美拉德反應，而CIA的活性中心沒有賴氨酸殘基和精氨酸殘基。由以上結果可知，在葡萄糖+BBI體系中，3 h熱處理后TIA降低了42%，其中熱誘導構象改變貢獻了19%，而2 mg/mL葡萄糖貢獻了23%；在果糖+BBI體系中，3 h熱處理降低了31%的TIA，其中熱誘導構象改變貢獻了19%，而2 mg/mL果糖貢獻了12%。

2.3 加熱條件下大豆蛋白對BBI活性影響

豆漿在熱處理過程中形成蛋白質聚集體，會將BBI包裹在聚集體內部從而使這部分BBI失去活性[21]。圖4a和4b顯示大豆蛋白對TIA的影響不大，對CIA的影響程度隨時間延長逐漸增大。在沸水浴3 h條件下，大豆蛋白+BBI體系的TIA下降了23%，而BBI單純體系下降了20%，說明大豆蛋白貢獻了3%的下降率；大豆蛋白+BBI體系的CIA下降了50%，而BBI單純體系下降了23%，說明大豆蛋白貢獻了27%的下降率。

圖4 加熱條件下大豆蛋白對BBI（22 mmgg/mL）活性的影響Fig. 4 Effects of SP on BBI activity under heating condition

圖4 c、d顯示，大豆蛋白質量濃度越大，對于TIA，尤其是CIA，影響越大。這與BBI的結構密切相關，BBI的胰蛋白酶抑制活性中心的穩定性強于胰凝乳蛋白酶抑制活性中心[29-30]。因此，胰凝乳蛋白酶抑制活性中心空間構象較易發生變化，與大豆蛋白發生相互作用，從而影響胰凝乳蛋白酶抑制中心活性的表達；而胰蛋白酶抑制活性中心空間結構不易被破壞，與大豆蛋白相互作用弱，從而促進TIA失活比較慢。上述結果說明大豆蛋白對BBI的CIA影響較大，對TIA影響較小；蛋白質量濃度增大，也會加快TIA失活，尤其是CIA。

BBI與大豆蛋白發生相互作用有兩種方式，一種是非共價鍵相互作用，另一種是共價鍵相互作用。一個BBI分子含有7 個二硫鍵，而大豆蛋白含有游離巰基，由此可推測BBI可能會與大豆蛋白發生巰基/二硫鍵交換反應。基于此，可通過非還原電泳考察BBI與大豆蛋白之間的二硫鍵連接，通過對角線電泳考察BBI與哪些蛋白成分之間產生了二硫鍵連接。圖5a顯示加熱對大豆蛋白+BBI和BBI單純體系的影響（非還原電泳），隨著加熱時間延長，BBI條帶強度逐漸減弱。對圖5a中的BBI條帶強度進行分析（圖5b），結果顯示大豆蛋白+BBI體系的BBI條帶強度減弱速率快于BBI單純體系，這說明BBI與大豆蛋白發生了巰基/二硫鍵交換反應。通過對角線電泳（圖5c），結果顯示BBI不但可以與大豆球蛋白的酸性肽鏈和堿性肽鏈等蛋白成分形成多聚體，還可與堿性肽鏈形成二聚體；另外，BBI還可形成BBI二聚體。

圖5 加熱條件下BBI與大豆蛋白之間二硫鍵連接Fig. 5 Disul fide bond linkage between BBI and SP under heating condition

3 結 論

本研究利用模型體系考察豆漿成分對BBI活性的影響。首先考察豆漿中的還原糖對BBI活性的影響，結果顯示：在未加熱條件下，葡萄糖有增強BBI活性的作用，而果糖則沒有；在加熱條件下，還原糖對BBI的TIA影響很大，而對CIA影響非常小；葡萄糖對BBI的TIA影響程度比果糖大。葡萄糖+BBI（2 mg/mL葡萄糖、2 mg/mL BBI）體系中，沸水浴3 h后TIA降低了42%，其中熱誘導構象改變貢獻了19%，葡萄糖貢獻了23%；果糖+BBI體系中，3 h熱處理降低了31%的TIA，其中熱誘導構象改變貢獻了19%，而2 mg/mL果糖貢獻了12%。

考察大豆蛋白對BBI活性的影響，結果顯示：大豆蛋白對BBI的CIA影響程度大于TIA；BBI可與大豆球蛋白的堿性肽鏈形成二聚體，也可與大豆球蛋白形成多聚體；BBI可形成二聚體。沸水浴3 h條件下，大豆蛋白+BBI體系（2 mg/mL大豆蛋白、2 mg/mL BBI）的TIA下降了23%，而BBI單純體系下降了20%，大豆蛋白貢獻了3%；大豆蛋白+BBI體系的CIA下降了50%，而BBI單純體系下降了23%，大豆蛋白貢獻了27%。