固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)麗江瑪咖中41種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留

黃紹軍，杜 萍，楊 俊,*，孫 卉，朱艷琴，孫曉東，邱麗莎，崔秀明，楊 野

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心（云南省分析測(cè)試中心），云南 昆明 650093）

瑪咖（Lepidium meyeniiWalp）原產(chǎn)于海拔3 500～4 500 m的秘魯安第斯高山地區(qū)，為十字花科（Cruciferae）獨(dú)行菜屬（Lepidium）草本植物的新鮮或干燥塊根[1]。研究表明，瑪咖是世界上發(fā)現(xiàn)的營(yíng)養(yǎng)成分最豐富的藥食兩用植物之一[2-3]。瑪咖中不僅含有多種氨基酸、多種維生素、蛋白質(zhì)、多糖、還原糖、脂肪酸和不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分[1,4-5]，還含有芥子油苷、異硫氰酸芐酯、瑪咖酰胺、瑪咖烯、生物堿、牛磺酸、甾醇、黃酮、礦物質(zhì)元素等生物活性物質(zhì)[1,6-8]，具有提高生育力和改善性功能、抗衰老、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和緩解女性更年期綜合癥、抗抑郁、抗疲勞和耐缺氧、提高記憶力和增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力、增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗炎癥、抗病毒、抗貧血、降糖、降血脂、抑制骨質(zhì)疏松、抗前列腺增生等功效[4-7,9-11]。因此，瑪咖素有“秘魯人參”[12]和“瑪咖醫(yī)生”[13]的美稱，具有重要藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)于2003年在云南麗江引種瑪咖并栽培成功，并相繼在四川、西藏、新疆、青海、貴州、吉林等地區(qū)引種成功[7,14]，2011年瑪咖被列入我國(guó)食品新資源目錄并開(kāi)始大面積種植[4]。云南麗江與瑪咖原產(chǎn)地秘魯同處于高緯度、高海拔地區(qū)，氣候類似，晝夜溫差大，特別適合瑪咖生長(zhǎng)，成為我國(guó)瑪咖主產(chǎn)區(qū)，2015年瑪咖種植面積突破9 333 hm2[14]。研究表明，云南麗江瑪咖品質(zhì)接近或優(yōu)于秘魯瑪咖[2]。瑪咖為高寒山區(qū)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化、農(nóng)民脫貧致富提供了一條新途徑。

近年來(lái)，農(nóng)藥已在農(nóng)作物和中藥材種植中廣泛應(yīng)用，造成了未加工原材料中的農(nóng)藥殘留。因此，在農(nóng)副產(chǎn)品和中藥材投入使用之前，很有必要進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)，以提高在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。廣譜性殺蟲(chóng)劑如有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥曾在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。有機(jī)氯農(nóng)藥雖然早已被各國(guó)明令禁止使用，但由于其具有毒性大、性質(zhì)穩(wěn)定和降解緩慢等特點(diǎn)[15]，能長(zhǎng)期殘留于土壤和農(nóng)副產(chǎn)品中；菊酯類農(nóng)藥具有速效、低毒等特點(diǎn)而至今都被廣泛使用[16]，但其大量使用也會(huì)導(dǎo)致在土壤和農(nóng)副產(chǎn)品中的積聚并通過(guò)生物鏈轉(zhuǎn)移和富集到動(dòng)物和人體內(nèi)，引起人畜中毒，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成很大危害。鑒于有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥都具有較大的神經(jīng)毒性[17]，我國(guó)制定的2015年版《中國(guó)藥典》和多個(gè)農(nóng)藥殘留量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[18]對(duì)中藥材和農(nóng)副產(chǎn)品中有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥的最高殘留量進(jìn)行了嚴(yán)格限制。目前，國(guó)內(nèi)多依據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[19-20]以及食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[21]測(cè)定農(nóng)副產(chǎn)品中的有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留量，但這些標(biāo)準(zhǔn)中的方法存在前處理繁瑣耗時(shí)，溶劑使用量大，農(nóng)藥需分成多組使用雙柱測(cè)試，廣譜性農(nóng)藥無(wú)法一次性檢測(cè)等問(wèn)題。因此，很有必要建立一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的能同時(shí)檢測(cè)多種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留量的方法。

有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥含有鹵素、 氧等電負(fù)性較大的元素以及具有高溫可氣化特點(diǎn)，通常用氣相色譜（gas chromatography，GC）進(jìn)行分離后，用電子捕獲檢測(cè)器（electronic capture detector，ECD）[22-23]或質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）[24-25]進(jìn)行定性/定量檢測(cè)。其中GC-MS方法中一般使用全掃模式定性，采用選擇離子掃描（selective ion monitoring，SIM）方式或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式定量，而MS的MRM模式特異性強(qiáng)、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高，是目前最靈敏的MS模式，尤其適合于復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。目前關(guān)于瑪咖的研究主要集中在活性組分或功能性成分、營(yíng)養(yǎng)成分、揮發(fā)性成分等化學(xué)成分的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定、功效等方面[2]，而對(duì)于瑪咖中農(nóng)藥殘留量卻鮮有報(bào)道。瑪咖成分復(fù)雜，首先要建立合適的樣品前處理方法，使瑪咖中微量的農(nóng)藥成分被充分提取出來(lái)，然后通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)膬艋椒ūM量消 除基質(zhì)的干擾。固相萃取柱是從層析柱發(fā)展起來(lái)的一種用于萃取、分離、濃縮的樣品前處理裝置，高效、高選擇性的固定相可實(shí)現(xiàn)對(duì)干擾雜質(zhì)的選擇性吸附，基于固相萃取的樣品前處理方法具有溶劑用量少、快速、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、污染少、回收率良好等優(yōu)點(diǎn)而受到廣大研究者們的青睞[26]。本實(shí)驗(yàn)擬采用超聲波輔助提取、固相萃取凈化技術(shù)對(duì)瑪咖樣品進(jìn)行前處理，用含中等極性固定相的毛細(xì)管單柱GC分離殘留農(nóng)藥，以MS的全掃模式、MRM模式聯(lián)合外標(biāo)法分別對(duì)41 種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行定性和定量，旨在建立一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、適合大批量瑪咖樣品中有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留的快速篩查和定量檢測(cè)方法，應(yīng)用推廣性強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：瑪咖干樣，采樣地點(diǎn)為云南麗江市玉龍縣。

石墨化碳/氨基復(fù)合型小柱（500 mg/500 mg/6 mL）天津博納艾杰爾科技有限公司；0.45 μm有機(jī)相濾膜天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；氦氣（純度≥99.999%）四川梅塞爾氣體產(chǎn)品有限公司；氬氣（純度≥99.999%）梅塞爾格里斯海姆（昆明）氣體產(chǎn)品有限公司；乙腈、甲苯、正己烷、丙酮（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品：百菌清（101.4 μg/mL）、聯(lián)苯菊酯（99.0 μg/mL）、25 種有機(jī)氯農(nóng)藥混合溶液（100 μg/mL）、23 種農(nóng)藥混合溶液（100 μg/mL）美國(guó)A ChemTek. Inc.公司。

1.2 儀器與設(shè)備

456-GC/SCION TQ GC-MS聯(lián)用儀（配置電子電離源和質(zhì)量分析器） 德國(guó)布魯克公司；TDL-40B離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；SB-5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

瑪咖干果經(jīng)粉碎后稱取5 g，加入去離子水20 mL，振蕩使混勻，加入乙腈25 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液收集于預(yù)先放入8 g NaCl的50 mL塑料離心管中，超聲20 min促進(jìn)NaCl溶解于水層并分層，靜置約10 min使之徹底分層，取上層（乙腈層）10 mL，旋蒸至近干，用A液體（乙腈-甲苯（3∶1，V/V））2 mL溶解，采用石墨化碳/氨基復(fù)合型小柱凈化，用6 mL A液體轉(zhuǎn)出樣液，再用2 次6 mL A液體洗脫，經(jīng)凈化后收集的液體約20 mL，濃縮至近干，用2 mL正己烷溶解，再經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)試。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制及校準(zhǔn)曲線制作

分別移取0.20 mL百菌清（101.4 μg/mL）、0.20 mL聯(lián)苯菊酯（99.0 μg/mL）、0.20 mL 25 種有機(jī)氯農(nóng)藥混合溶液（100 μg/mL）、0.20 mL 23 種農(nóng)藥混合溶液（100 μg/mL）于同一個(gè)2 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得到農(nóng)藥質(zhì)量濃度10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn) 溶液（α-六六六、五氯硝基苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的質(zhì)量濃度均為20 μg/mL）；再采用逐級(jí)稀釋法，配制得到農(nóng)藥質(zhì)量濃度分別為4、2、0.5、0.1、0.05、0.02 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（α-六六六、五氯硝基苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的質(zhì)量濃度為其他農(nóng)藥質(zhì)量濃度的2 倍），上機(jī)分析制作校準(zhǔn)曲線。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 GC條件

色譜柱Agilent J&W DB-17MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He；載氣流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度290 ℃；分流方式：不分流；柱溫（程序升溫）：初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升溫至130 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min，最后以20 ℃/min升溫至300 ℃，保持7 min；進(jìn)樣量1 μL。

1.3.3.2 MS條件

電離方式：電子電離源；電離電壓：70 eV；燈絲電流：80 μA；碰撞氣（Ar）壓力：2.0 mTorr（相當(dāng)于0.27 Pa）；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；溶劑延遲時(shí)間：15 min；定性：全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍35～550 u；定量：MRM模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC條件的優(yōu)化

比較弱極性的HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.250 mm，0.2 5 μ m）和中等極性的D B-1 7 M S毛細(xì)管柱（30 m×0.250 mm，0.25 μm）對(duì)41 種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥的分離效果。結(jié)果表明，HP-5MS毛細(xì)管柱不能較好分離β-六六六與γ-六六六、乙烯菌核利與七氯、4,4’-滴滴滴與2,4’-滴滴涕、2,4’-滴滴伊與α-硫丹；DB-17MS毛細(xì)管柱能很好地分離前3 組，但在優(yōu)化條件下仍然不能有效地分離2,4’-滴滴伊與α-硫丹，不過(guò)2,4’-滴滴伊與α-硫丹的定性/定量離子都不相同，不影響離子的積分，因此選擇DB-17MS毛細(xì)管柱作為分離柱。

2.2 MS條件的優(yōu)化

圖1 41 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）的SIM總離子流（aa）和MRM（b）色譜圖Fig. 1 Total ion current (a) and multiple reaction monitoring (b)chromatograms of mixed solution 41 pesticide standards (at 10 μg/mL)

表1 41 種農(nóng)藥的MS MS-MRM模式下檢測(cè)參數(shù)Table 1 MRM parameters for MS MS detection of the 41 pesticides

采用SIM和MRM兩種模式對(duì)41 種農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)分析。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，采用MRM模式比采用SIM模式有更高的信噪比和靈敏度，并且MRM模式一方面能克服SIM模式中不同農(nóng)藥存在相同掃描離子而對(duì)定性/定量帶來(lái)的困擾，另一方面能有效提高多種農(nóng)藥同時(shí)檢測(cè)對(duì)分辨率的要求[27]。此外，MRM模式選擇性更好，抗干擾能力更強(qiáng)，更適合于復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)。因此，在MRM模式下，進(jìn)行MS參數(shù)的優(yōu)化。從全掃描MS圖（圖1a）上選擇質(zhì)荷比（m/z）大及豐度高的離子定為母離子，設(shè)定不同的碰撞能量對(duì)母離子進(jìn)行轟擊得到子離子MS/MS掃描圖，從中選擇響應(yīng)值最高的2～3 個(gè)碎片離子作為子離子，改變碰撞電壓優(yōu)化各組母離子和子離子[28]。最后選擇響應(yīng)最好的組合，確定了41 種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥MRM的最佳MS條件，MRM-MS圖見(jiàn)圖1b，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

乙腈對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥均有較好的溶解度且脂肪在乙腈中的溶解度較小[29]，且乙腈具有極性大、穿透力強(qiáng)、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[30]，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑；而通常的提取方式有機(jī)械振蕩、索氏提取、超聲波輔助提取等[31]。考慮到實(shí)驗(yàn)室可行條件及 方法適合推廣的要求，本研究采用乙腈溶解超聲波輔助提取的方式。瑪咖干粉中先加入一定量水是為了使瑪咖充分地浸潤(rùn)，一方面有利于乙腈更好地滲透到瑪咖顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)中去，另一方面水可以除去瑪咖中大部分多糖、還原糖、蛋白等水溶性成分[32]。提取液經(jīng)過(guò)濾后加入氯化鈉超聲助溶使水相形成氯化鈉飽和溶液，有利于水相與有機(jī)相的分離。

用于有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥多殘留樣品處理的最常用的凈化柱主要包括氨基固相萃取柱、弗羅里硅土柱、C18柱、石墨化碳黑柱、石墨化碳/氨基復(fù)合柱等[15,29,33]。一般認(rèn)為復(fù)合凈化劑比單一凈化劑效果好，而由于石墨化碳/氨基復(fù)合柱處理樣品較為干凈、干擾峰少，有較好的回收率，在農(nóng)殘樣品前處理方面的應(yīng)用日益廣泛[34]。因此，本研究選擇石墨化碳/氨基復(fù)合柱凈化處理 瑪咖樣品提取液，見(jiàn)圖2，而洗脫液選用乙腈-甲苯（3∶1，V/V）混合溶劑。石墨化碳經(jīng)過(guò)特殊表面處理，對(duì)平面結(jié)構(gòu)的化合物如色素有很強(qiáng)的吸附能力，可以去除色素的干擾[35]，氨基鍵合硅膠則可以除去金屬離子、極性有機(jī)酸、酚類和某些糖類雜質(zhì)[15]。在保證良好回收率的前提下，本研究中的樣品前處理方法相對(duì)于目前大多數(shù)常見(jiàn)的樣品前處理方法具有更簡(jiǎn)便省時(shí)、節(jié)省有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)，見(jiàn)表2。

圖2 石墨化碳/氨基復(fù)合柱凈化示意圖Fig. 2 Schematic of the Purification with graphite carbon/amino composite column

表2 不同檢測(cè)方法和樣品前處理方法的特征參數(shù)比較Table 2 Comparison of characteristic parameters between different analytical methods with different sample pretreatments

2.4 線性范圍和檢出限

配制0.02、0.05、0.1、0.5、2、4、10 μg/mL 7 個(gè)質(zhì)量濃度（其中α-六六六、五氯硝基苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的各級(jí)質(zhì)量濃度皆為相應(yīng)質(zhì)量濃度的2 倍）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)試，以農(nóng)藥定量離子的峰面積y為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程，以3 倍信噪比（RSN）計(jì)算檢出限，結(jié)果見(jiàn)表3。41 種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥在0.02～10 μg/mL或0.04～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，檢出限為0.01～2.38 μg/kg，此值比采用ECD的GC法以及其他GC-MS聯(lián)用法檢測(cè)獲得的檢出限整體低1～3 個(gè)數(shù)量級(jí)（表2）。

表3 41 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、和檢出限Table 3 Standard curve equations, linear ranges, R2 and LODs for the 41 pesticides

續(xù)表3

2.5 方法的精密度和回收率

在空白基質(zhì)中分別添加0.018、0.074、0.36 mg/kg三個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液做回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6 次。方法的精密度用6 次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。結(jié)果表明，41 種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率為90.2%～108.8%，RSD為2.1%～10.9%，見(jiàn)表4。

表4 41 種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥在空白基質(zhì)中的平均回收率及RSD（ =6）Table 4 Average recoveries and precision of the 41 organochlorine and pyrethroid pesticides spiked into blank matrices (n = 6)

續(xù)表4

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

表5 瑪咖樣品信息Table 5 Levels of pesticide residues in real samples determined by the GGCC--MMSS/MS metthhoodd

為驗(yàn)證麗江瑪咖食用的安全性，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了該產(chǎn)地10 種瑪咖中41 種農(nóng)藥殘留情況。由表5可知，在這10 種樣品中，5 種樣品未檢出任何農(nóng)藥殘留，另外5 個(gè)樣品中檢出了少量腐霉利、多效唑、氯菊酯、醚菊酯，但都明顯低于GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對(duì)于根莖類和薯芋類蔬菜的最大殘留限量。況且，腐霉利、多效唑、氯菊酯、醚菊酯等屬于低毒、高效、在哺乳動(dòng)物體內(nèi)蓄積性很小的農(nóng)藥。由此可見(jiàn)，麗江瑪咖除了品質(zhì)高以外，食用安全性也很高。

3 結(jié) 論

由于瑪咖樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，瑪咖樣品中的農(nóng)藥殘留分析通常不容易獲得準(zhǔn)確而穩(wěn)定的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)GC條件、MS條件、樣品前處理方法等進(jìn)行選擇和優(yōu)化，建立了超聲波輔助提取-固相萃取凈化-GC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定瑪咖中41 種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留的分析方法。方法簡(jiǎn)捷、快速、凈化效果好、靈敏度高、選擇性好、回收率好、重復(fù)性好，可滿足復(fù)雜基質(zhì)瑪咖樣品中有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留的快速篩查定性和定量分析要求。