元素指紋圖譜用于安化黑茶的原產(chǎn)地判別

楊 純，顏鴻飛，呂小園，陸 靜，賀 鵬

（長(zhǎng)沙海關(guān)技術(shù)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

湖南安化黑茶因其具有上乘的特殊保健功效如降脂減肥、改善消化道、防癌抗癌等和深厚的文化底蘊(yùn)而迅速發(fā)展和興起，其獨(dú)特的制作工藝已列入國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。安化黑茶已獲得中國(guó)馳名商標(biāo)和地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)的稱號(hào)，深受消費(fèi)者喜愛[1]。近幾年市場(chǎng)上出現(xiàn)部分外路劣質(zhì)茶（非正宗安化黑茶）加工成“安化黑茶”，大大影響了購(gòu)茶者的消費(fèi)信心，給湖南安化黑茶的聲譽(yù)帶來(lái)了嚴(yán)重影響。目前，安化黑茶的鑒別主要靠業(yè)內(nèi)人士憑感官經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行鑒別，沒有系統(tǒng)有效的區(qū)分方法。現(xiàn)有保護(hù)安化黑茶的標(biāo)準(zhǔn)和公告等因其可以依據(jù)的理化成分指標(biāo)較少且簡(jiǎn)單，難以將安化黑茶與其他產(chǎn)地黑茶區(qū)分開來(lái)。為了保護(hù)安化黑茶品牌，使地理標(biāo)志產(chǎn)品、名優(yōu)特產(chǎn)品的健康發(fā)展，需要使用科學(xué)的技術(shù)手段進(jìn)行鑒別和區(qū)分檢測(cè)，所以開發(fā)出一種湖南安化黑茶的產(chǎn)地溯源與鑒別方法成為必要[2-3]。

產(chǎn)地溯源旨在探尋表征不同地域來(lái)源產(chǎn)品的特異性指標(biāo)[4-9]。茶葉品質(zhì)與其產(chǎn)地的氣候條件及加工方法有密切關(guān)系，不同產(chǎn)地茶葉中礦質(zhì)元素含量存在一定的差異性[10-14]。近些年來(lái)，國(guó)際上應(yīng)用礦物元素分析技術(shù)在產(chǎn)地溯源方面取得了較好的成果。Marcos[15]、Fernández-Cáceres[16]、Moreda-Pi?eiro[17]等用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）對(duì)來(lái)自不同國(guó)家茶葉分別進(jìn)行元素分析及產(chǎn)地溯源，可成功將中國(guó)茶葉與其他國(guó)家茶葉區(qū)分。近些年來(lái)，礦質(zhì)元素指紋圖譜分析技術(shù)在產(chǎn)地溯源方面取得了較好的成果[18-21]。現(xiàn)代儀器分析技術(shù)已經(jīng)成為比較新型的茶葉分類、品質(zhì)鑒定方法[22-23]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ICP-MS高通量光譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)湖南安化黑茶、云南普洱茶、廣西六堡茶和湖北青磚茶共49 個(gè)茶葉樣品中B、Li、P等48 種元素組分進(jìn)行定量分析，得到黑茶元素指紋圖譜，找尋有效區(qū)分識(shí)別湖南安化黑茶原產(chǎn)地特征元素指標(biāo)，建立對(duì)湖南安化黑茶產(chǎn)地來(lái)源進(jìn)行判別分析模型，以期為制定湖南安化黑茶可量化的原產(chǎn)地判別標(biāo)準(zhǔn)以及摻假識(shí)偽提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取不同產(chǎn)地的49 個(gè)黑茶樣品進(jìn)行研究，其中湖南安化黑茶22 個(gè)樣品，購(gòu)自湖南安化縣茶廠；云南普洱茶樣品13 個(gè)，廣西六堡茶樣品8 個(gè)，湖北青磚茶樣品6 個(gè)，購(gòu)自湖南茶葉市場(chǎng)，茶葉樣品具體信息見表1。

硝酸（優(yōu)級(jí)純）；超純水；茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10083） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；48 種元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL） 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

表1 茶葉樣品Table 1 Geographical origins of tea samples tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

iCAP Q型ICP-MS儀 美國(guó)賽默飛公司；MARS6 Onetouch型高壓微波消解器 美國(guó)CEM公司；ML204型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用5%稀硝酸溶液將48 種1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋配成以下質(zhì)量濃度：P、Al、K、Ca、Fe、Mg、Na質(zhì)量濃度為100、500、1 000、3 000、5 000 μg/L；Cu、Ti、Mn、Rh、Zn、Sr質(zhì)量濃度為10、50、100、300、500 μg/L；B、Li、Be、As、Cd、Pb、Ga、V、Cr、Rb、Co、Ni、Se、Sn、Te、Mo、Cs、Sb、Ba、Tl、Tm、Yb、Ho、Er、Tb、Dy、Gd、Eu、Sm、Nd、La、Ce、Pr、Y、Lu質(zhì)量濃度為1、5、10、30、50 μg/L。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液配制

用5% HNO3溶液將1 000 μg/mL的Sc、Ge、In、Bi、Re標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋為50 μg/L混合內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.3 元素含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)中所用的茶葉樣品用食品攪拌機(jī)打碎，過(guò)60 目篩，貯存于塑料試樣袋中。將樣品于（103±2）℃（設(shè)定值103 ℃）烘干至質(zhì)量恒定，用樣品袋密封后放置于干燥器中保存待用。稱取烘干茶葉樣品約0.5 g（精確至0.000 1 g）置于四氟乙烯消化管內(nèi)，加入5 mL硝酸，浸泡過(guò)夜，然后放入高壓微波消解儀內(nèi)進(jìn)行消解，程序如表2所示。樣品消解完全后取出，置于趕酸裝置中于180 ℃趕酸，當(dāng)消解液剩余約0.5 mL停止趕酸，冷卻，將樣品轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，待測(cè)。隨同制備樣品空白溶液。將標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品空白溶液、樣品溶液依次導(dǎo)入ICP-MS進(jìn)行元素含量測(cè)定，具體ICP-MS儀器參數(shù)見表3。

表2 微波消解程序Table 2 Optimal procedure of microwave digestion

表3 ICP-MS工作參數(shù)Table 3 Operating parameters of ICP-MS

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19和SIMCA P 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的變量篩選、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

按照本法對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品茶葉（GBW10083）中14 種元素進(jìn)行6 次平行測(cè)定，結(jié)果見表4。表明本方法的測(cè)定值與茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品標(biāo)準(zhǔn)值具有良好的一致性，樣品前處理和儀器測(cè)定準(zhǔn)確度均符合實(shí)驗(yàn)分析要求。

表4 茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 4 Certi fied and measured values of 14 elements in tea reference material

2.2 顯著差異元素分析

表5 不同產(chǎn)地黑茶樣品的48 個(gè)元素含量Table 5 Contents of 48 elements in Anhua dark tea from different geographical origgiinnss

不同產(chǎn)地黑茶中48 種元素含量測(cè)定結(jié)果見表5。黑茶中所有含的元素含量差異很大，K含量很高，均在15 000 mg/kg以上。P、Al、Ca、Mn、Mg含量在1 000～6 700 mg/kg之間，Te和Lu未檢出，不同產(chǎn)地黑茶元素含量也各有其特征。云南和廣西由于地理位置較近，所測(cè)元素含量都較接近，數(shù)據(jù)顯示僅Rb、Co、Mo、Cs、Na、Tl、Ce在兩地間的差異區(qū)分較為明顯。4 個(gè)產(chǎn)地黑茶中湖北產(chǎn)地黑茶所測(cè)的元素含量大部分偏高，如Al、Pb、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe等，原始數(shù)據(jù)顯示每個(gè)省份平均含量差異顯著的元素有Pb、Li、Ce、Ba、Gd、Ga等，對(duì)于組間類別區(qū)分較明顯。進(jìn)一步對(duì)48 種元素含量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，在α=0.05水平上有顯著差異的變量元素19 種，分別為L(zhǎng)i、Pb、Ga、V、Cr、Fe、Rb、Mo、Cs、Sb、Ba、Na、Tl、Gd、Sm、Nd、La、Ce、Pr。

2.3 PCA結(jié)果

表6 主成分的方差貢獻(xiàn)率Table 6 Eigenvalues and contribution rates to total variance of principal components

圖1 黑茶樣品的主成分得分投影圖Fig. 1 PCA score plots of dark tea samples

主成分得分投影圖能夠直觀地反映樣本間的相似或差異性，能夠進(jìn)行各類樣本的分布規(guī)律、品種分類、產(chǎn)地溯源和品質(zhì)分級(jí)等研究[24,27]。本實(shí)驗(yàn)為得到黑茶樣品的產(chǎn)地類別聚集趨勢(shì)規(guī)律及特征，對(duì)49 個(gè)茶葉樣品和19 種顯著性差異元素含量的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，得到前5 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.441%，其中第1主成分貢獻(xiàn)率為53.906%，前2 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為68.964%，結(jié)果見表6。進(jìn)一步運(yùn)用SIMCA P 11.5進(jìn)行PCA，得到以湖南安化黑茶和其他產(chǎn)地黑茶在PC1和PC2上的主成分得分投影圖（圖1）。由圖1可知，安化黑茶和其他產(chǎn)地黑茶樣品二維空間中的分布呈現(xiàn)出較好的類別聚集趨勢(shì)。

2.4 PLS-DA結(jié)果

PLS-DA法可以消除相互重疊的數(shù)據(jù)信息，尤其是當(dāng)自變量個(gè)數(shù)大于觀察量個(gè)數(shù)時(shí)，其數(shù)據(jù)分析結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠[26]。為尋找更為有效的安化黑茶識(shí)別分析方法，本實(shí)驗(yàn)利用PLS-DA進(jìn)行判別分析，通過(guò)每個(gè)樣本點(diǎn)在PLS-DA得分圖上的相對(duì)位置和分布情況顯示樣本的分類信息，從而達(dá)到樣品識(shí)別的目的。本實(shí)驗(yàn)將49 個(gè)茶葉樣本和19 個(gè)顯著性差異元素含量的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)作為變量，建立數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)茶葉產(chǎn)地信息的4 個(gè)類別即類別1（湖南安化黑茶）、類別2（云南普洱茶）、類別3（廣西六堡茶）和類別4（湖北青磚茶），進(jìn)行PLS-DA，所得PLS-DA圖，見圖2。湖南安化黑茶分布比較集中，云南普洱茶分布較為分散，廣西和云南地域接近，茶葉特征（元素含量分布特征或指紋特征）較為接近，有部分交叉現(xiàn)象。但是湖南安化黑茶與其他產(chǎn)地黑茶類別聚集明顯，都較為集中地分布在各自特征區(qū)域，能夠很好地將湖南安化產(chǎn)地黑茶與其他產(chǎn)地茶進(jìn)行識(shí)別。

圖2 湖南安化黑茶與其他產(chǎn)地茶葉的PLSS--DDAAFig. 2 PLS-DA plot of Hunan Anhua dark tea and those from other regions

2.5 逐步判別分析

從茶葉樣品中各元素指標(biāo)的方差分析、PCA和PLS-DA結(jié)果可以看出，利用元素指紋圖譜分析技術(shù)對(duì)湖南安化黑茶的原產(chǎn)地判別可行。為進(jìn)一步了解各元素含量對(duì)黑茶產(chǎn)地的判別情況，對(duì)19 種特征元素含量的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)按照統(tǒng)計(jì)量Wilk's λ最小值原則選擇變量，進(jìn)行逐步判別分析，建立判別方程。結(jié)果顯示Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na 7 種元素先后被引入判別模型中，所建立的判別模型如下：

類別1（湖南安化黑茶）=－5.274－0.406（Li）－5.371（Pb）+6.173（Ga）－1.480（Ce）－5.052（Rb）－4.513（Cs）－1.201（Na）

類別2（云南普洱茶）=－10.139－10.639（Li）+2.742（Pb）－5.568（Ga）+0.050（Ce）+3.463（Rb）+0.288（Cs）+3.846（Na）

類別3（廣西六堡茶）=－33.465+0.228（Li）+6.700（Pb）－12.156（Ga）－3.591（Ce）+17.773（Rb）+11.232（Cs）+2.167（Na）

類別4（湖北青磚茶）=－16.329－4.953（Li）+10.681（Pb）－6.363（Ga）+12.182（Ce）－4.213（Rb）－1.005（Cs）－0.239（Na）

利用此模型對(duì)樣品進(jìn)行歸類，進(jìn)行回代檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證分析（表7），回代檢驗(yàn)判別率為100%，交叉驗(yàn)證判別率為98%，說(shuō)明Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na這7 種元素指標(biāo)對(duì)黑茶產(chǎn)地判別效果好。熟度較高，且礦物質(zhì)集中的成熟葉、莖、梗一同作為原料發(fā)酵，礦質(zhì)元素含量比其他茶類較高。黑茶原料黑毛茶采摘的時(shí)節(jié)、級(jí)別、樹種等對(duì)茶葉的元素含量也存在影響。再次，可能與安化黑茶獨(dú)特的加工工藝有關(guān)。安化黑茶最具特征的工序是在初制進(jìn)程中的“渥堆”發(fā)酵工序與“松柴明火”干燥工序及在精制過(guò)程中“渥堆”等過(guò)程，都對(duì)茶葉元素含量都存在一定的影響。總之，茶葉元素含量指紋特征是土壤環(huán)境、工藝、原料、茶樹等多種因素的綜合影響結(jié)果。因此，需要進(jìn)一步研究分析安化黑茶的產(chǎn)地土壤環(huán)境、原料品種、加工工藝、茶樹種類等對(duì)黑茶元素含量的影響，才能更加系統(tǒng)闡述和探究安化黑茶礦物質(zhì)元素指紋特征的形成原因，為安化黑茶的產(chǎn)地溯源分析提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

表7 黑茶產(chǎn)地判別分析Table 7 Classi fication with discriminate analysis of dark tea samples

4 結(jié) 論

3 討 論

本研究采用ICP-MS法得到湖南安化黑茶的元素含量指紋圖譜信息，能夠較好地表征安化黑茶原產(chǎn)地特征。不同產(chǎn)地黑茶樣品微量元素種類基本相同，但一些元素含量差異顯著。各產(chǎn)地黑茶有著各自的特征元素，相鄰地區(qū)樣品元素含量和特征元素相近，如湖南與湖北黑茶元素含量較為接近，云南與廣西黑茶元素含量相近。安化黑茶中微量元素種類較豐富，其中含量較高最具代表的礦物元素為P、Cu、Al、K、Cr、Ca、Mn、Fe、Zn、Ba、Na、Mg，其中Zn、Mn、Cu為超氧化物歧化酶的構(gòu)成元素，具抗氧化作用，含量分別高達(dá)35.529、1 471.8、19.039 mg/kg，對(duì)人體健康大有益處；稀土元素的含量較低，如Cs、Gd、Sm、Nd、La、Ce、Pr等，過(guò)量的稀土元素會(huì)影響茶葉的品質(zhì)危害人體健康[28-29]。與其他產(chǎn)地黑茶存在明顯差異的特征元素為稀土元素（以Ce為突出代表，以及Cs、Gd、Sm、Nd、La、Pr等），以及被引入判別模型的堿金屬元素Li、Na、Rb、Cs。安化黑茶以上顯著性元素特征可能與安化縣茶葉生長(zhǎng)土壤相關(guān)。安化縣內(nèi)土壤以板頁(yè)巖風(fēng)化發(fā)育的土地面積最廣，茶園土質(zhì)較好，土壤以酸性和弱性為主，酸堿度適宜，養(yǎng)分含量較高[30]。這些特征元素能夠較好地表征安化黑茶原產(chǎn)地特征，可以作為鑒別安化黑茶產(chǎn)地的重要技術(shù)指標(biāo)。

“安化黑茶”作為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，主要指產(chǎn)自于湖南省安化縣內(nèi)特定生長(zhǎng)區(qū)域，采用安化雪峰山脈茶區(qū)的大葉種群體品種為原料，經(jīng)過(guò)四大復(fù)雜的工藝加工而成，具有明顯的地域性[30]。首先植物中礦物元素含量特征與其產(chǎn)地環(huán)境中礦質(zhì)元素的含量密切相關(guān)。安化黑茶元素含量與安化地域獨(dú)特的地理位置和土質(zhì)有關(guān)，氮、鉀和硒等有機(jī)質(zhì)含量豐富。其次，可能與安化黑茶的加工原料黑毛茶有關(guān)。安化黑茶采制原料黑毛茶的成

本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS對(duì)安化黑茶及其他產(chǎn)地黑茶中的B、Li、P等48 種元素組分進(jìn)行定量分析，得到黑茶元素指紋圖譜。利用方差分析得到具有顯著性差異的元素有Li、Pb、Ga等19 種，云南和廣西由于地理位置較近，所測(cè)元素含量都較接近，4 個(gè)產(chǎn)地黑茶中湖北產(chǎn)地黑茶所測(cè)的元素含量大部分偏高；利用PCA和PLS-DA對(duì)湖南安化黑茶與其他產(chǎn)地黑茶類別進(jìn)行判別分析，得到主成分得分投影圖和PLS-DA圖，各個(gè)產(chǎn)地的黑茶樣品在各自特征區(qū)域聚集較明顯，能對(duì)湖南安化黑茶與其他原產(chǎn)地黑茶進(jìn)行有效區(qū)分和識(shí)別；采用逐步分析得到4 個(gè)產(chǎn)地判別模型，其中被引入產(chǎn)地判別模型的元素有7 種，依次為L(zhǎng)i、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na，所建立的判別模型對(duì)樣品回代檢驗(yàn)判別率為100%，交叉驗(yàn)證判別率為98%。結(jié)果表明基于元素指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)湖南安化黑茶的原產(chǎn)地判別可行。