元素指紋圖譜用于安化黑茶的原產(chǎn)地判別

楊 純，顏鴻飛，呂小園，陸 靜，賀 鵬

（長沙海關技術中心，湖南 長沙 410004）

湖南安化黑茶因其具有上乘的特殊保健功效如降脂減肥、改善消化道、防癌抗癌等和深厚的文化底蘊而迅速發(fā)展和興起，其獨特的制作工藝已列入國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。安化黑茶已獲得中國馳名商標和地理標志產(chǎn)品保護的稱號，深受消費者喜愛[1]。近幾年市場上出現(xiàn)部分外路劣質(zhì)茶（非正宗安化黑茶）加工成“安化黑茶”，大大影響了購茶者的消費信心，給湖南安化黑茶的聲譽帶來了嚴重影響。目前，安化黑茶的鑒別主要靠業(yè)內(nèi)人士憑感官經(jīng)驗進行鑒別，沒有系統(tǒng)有效的區(qū)分方法。現(xiàn)有保護安化黑茶的標準和公告等因其可以依據(jù)的理化成分指標較少且簡單，難以將安化黑茶與其他產(chǎn)地黑茶區(qū)分開來。為了保護安化黑茶品牌，使地理標志產(chǎn)品、名優(yōu)特產(chǎn)品的健康發(fā)展，需要使用科學的技術手段進行鑒別和區(qū)分檢測，所以開發(fā)出一種湖南安化黑茶的產(chǎn)地溯源與鑒別方法成為必要[2-3]。

產(chǎn)地溯源旨在探尋表征不同地域來源產(chǎn)品的特異性指標[4-9]。茶葉品質(zhì)與其產(chǎn)地的氣候條件及加工方法有密切關系，不同產(chǎn)地茶葉中礦質(zhì)元素含量存在一定的差異性[10-14]。近些年來，國際上應用礦物元素分析技術在產(chǎn)地溯源方面取得了較好的成果。Marcos[15]、Fernández-Cáceres[16]、Moreda-Pi?eiro[17]等用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）對來自不同國家茶葉分別進行元素分析及產(chǎn)地溯源，可成功將中國茶葉與其他國家茶葉區(qū)分。近些年來，礦質(zhì)元素指紋圖譜分析技術在產(chǎn)地溯源方面取得了較好的成果[18-21]?，F(xiàn)代儀器分析技術已經(jīng)成為比較新型的茶葉分類、品質(zhì)鑒定方法[22-23]。

本實驗應用ICP-MS高通量光譜檢測技術對湖南安化黑茶、云南普洱茶、廣西六堡茶和湖北青磚茶共49 個茶葉樣品中B、Li、P等48 種元素組分進行定量分析，得到黑茶元素指紋圖譜，找尋有效區(qū)分識別湖南安化黑茶原產(chǎn)地特征元素指標，建立對湖南安化黑茶產(chǎn)地來源進行判別分析模型，以期為制定湖南安化黑茶可量化的原產(chǎn)地判別標準以及摻假識偽提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取不同產(chǎn)地的49 個黑茶樣品進行研究，其中湖南安化黑茶22 個樣品，購自湖南安化縣茶廠；云南普洱茶樣品13 個，廣西六堡茶樣品8 個，湖北青磚茶樣品6 個，購自湖南茶葉市場，茶葉樣品具體信息見表1。

硝酸（優(yōu)級純）；超純水；茶葉標準物質(zhì)（GBW10083） 國家標準物質(zhì)研究中心；48 種元素的標準溶液（1 000 μg/mL） 中國計量科學研究院。

表1 茶葉樣品Table 1 Geographical origins of tea samples tested in this study

1.2 儀器與設備

iCAP Q型ICP-MS儀 美國賽默飛公司；MARS6 Onetouch型高壓微波消解器 美國CEM公司；ML204型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線繪制

用5%稀硝酸溶液將48 種1 000 μg/mL的標準溶液逐級稀釋配成以下質(zhì)量濃度：P、Al、K、Ca、Fe、Mg、Na質(zhì)量濃度為100、500、1 000、3 000、5 000 μg/L；Cu、Ti、Mn、Rh、Zn、Sr質(zhì)量濃度為10、50、100、300、500 μg/L；B、Li、Be、As、Cd、Pb、Ga、V、Cr、Rb、Co、Ni、Se、Sn、Te、Mo、Cs、Sb、Ba、Tl、Tm、Yb、Ho、Er、Tb、Dy、Gd、Eu、Sm、Nd、La、Ce、Pr、Y、Lu質(zhì)量濃度為1、5、10、30、50 μg/L。

1.3.2 內(nèi)標溶液配制

用5% HNO3溶液將1 000 μg/mL的Sc、Ge、In、Bi、Re標準溶液逐級稀釋為50 μg/L混合內(nèi)標溶液。

1.3.3 元素含量測定

實驗中所用的茶葉樣品用食品攪拌機打碎，過60 目篩，貯存于塑料試樣袋中。將樣品于（103±2）℃（設定值103 ℃）烘干至質(zhì)量恒定，用樣品袋密封后放置于干燥器中保存待用。稱取烘干茶葉樣品約0.5 g（精確至0.000 1 g）置于四氟乙烯消化管內(nèi)，加入5 mL硝酸，浸泡過夜，然后放入高壓微波消解儀內(nèi)進行消解，程序如表2所示。樣品消解完全后取出，置于趕酸裝置中于180 ℃趕酸，當消解液剩余約0.5 mL停止趕酸，冷卻，將樣品轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，待測。隨同制備樣品空白溶液。將標準曲線、樣品空白溶液、樣品溶液依次導入ICP-MS進行元素含量測定，具體ICP-MS儀器參數(shù)見表3。

表2 微波消解程序Table 2 Optimal procedure of microwave digestion

表3 ICP-MS工作參數(shù)Table 3 Operating parameters of ICP-MS

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用IBM SPSS Statistics 19和SIMCA P 11.5軟件進行數(shù)據(jù)的變量篩選、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉標準物質(zhì)測定結(jié)果

按照本法對國家標準物質(zhì)樣品茶葉（GBW10083）中14 種元素進行6 次平行測定，結(jié)果見表4。表明本方法的測定值與茶葉標準物質(zhì)樣品標準值具有良好的一致性，樣品前處理和儀器測定準確度均符合實驗分析要求。

表4 茶葉標準物質(zhì)測定結(jié)果Table 4 Certi fied and measured values of 14 elements in tea reference material

2.2 顯著差異元素分析

表5 不同產(chǎn)地黑茶樣品的48 個元素含量Table 5 Contents of 48 elements in Anhua dark tea from different geographical origgiinnss

不同產(chǎn)地黑茶中48 種元素含量測定結(jié)果見表5。黑茶中所有含的元素含量差異很大，K含量很高，均在15 000 mg/kg以上。P、Al、Ca、Mn、Mg含量在1 000～6 700 mg/kg之間，Te和Lu未檢出，不同產(chǎn)地黑茶元素含量也各有其特征。云南和廣西由于地理位置較近，所測元素含量都較接近，數(shù)據(jù)顯示僅Rb、Co、Mo、Cs、Na、Tl、Ce在兩地間的差異區(qū)分較為明顯。4 個產(chǎn)地黑茶中湖北產(chǎn)地黑茶所測的元素含量大部分偏高，如Al、Pb、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe等，原始數(shù)據(jù)顯示每個省份平均含量差異顯著的元素有Pb、Li、Ce、Ba、Gd、Ga等，對于組間類別區(qū)分較明顯。進一步對48 種元素含量進行單因素方差分析，結(jié)果顯示，在α=0.05水平上有顯著差異的變量元素19 種，分別為Li、Pb、Ga、V、Cr、Fe、Rb、Mo、Cs、Sb、Ba、Na、Tl、Gd、Sm、Nd、La、Ce、Pr。

2.3 PCA結(jié)果

表6 主成分的方差貢獻率Table 6 Eigenvalues and contribution rates to total variance of principal components

圖1 黑茶樣品的主成分得分投影圖Fig. 1 PCA score plots of dark tea samples

主成分得分投影圖能夠直觀地反映樣本間的相似或差異性，能夠進行各類樣本的分布規(guī)律、品種分類、產(chǎn)地溯源和品質(zhì)分級等研究[24,27]。本實驗為得到黑茶樣品的產(chǎn)地類別聚集趨勢規(guī)律及特征，對49 個茶葉樣品和19 種顯著性差異元素含量的標準化數(shù)據(jù)進行PCA，得到前5 個主成分累計貢獻率為88.441%，其中第1主成分貢獻率為53.906%，前2 個主成分累計貢獻率為68.964%，結(jié)果見表6。進一步運用SIMCA P 11.5進行PCA，得到以湖南安化黑茶和其他產(chǎn)地黑茶在PC1和PC2上的主成分得分投影圖（圖1）。由圖1可知，安化黑茶和其他產(chǎn)地黑茶樣品二維空間中的分布呈現(xiàn)出較好的類別聚集趨勢。

2.4 PLS-DA結(jié)果

PLS-DA法可以消除相互重疊的數(shù)據(jù)信息，尤其是當自變量個數(shù)大于觀察量個數(shù)時，其數(shù)據(jù)分析結(jié)果更加準確可靠[26]。為尋找更為有效的安化黑茶識別分析方法，本實驗利用PLS-DA進行判別分析，通過每個樣本點在PLS-DA得分圖上的相對位置和分布情況顯示樣本的分類信息，從而達到樣品識別的目的。本實驗將49 個茶葉樣本和19 個顯著性差異元素含量的標準化數(shù)據(jù)作為變量，建立數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)茶葉產(chǎn)地信息的4 個類別即類別1（湖南安化黑茶）、類別2（云南普洱茶）、類別3（廣西六堡茶）和類別4（湖北青磚茶），進行PLS-DA，所得PLS-DA圖，見圖2。湖南安化黑茶分布比較集中，云南普洱茶分布較為分散，廣西和云南地域接近，茶葉特征（元素含量分布特征或指紋特征）較為接近，有部分交叉現(xiàn)象。但是湖南安化黑茶與其他產(chǎn)地黑茶類別聚集明顯，都較為集中地分布在各自特征區(qū)域，能夠很好地將湖南安化產(chǎn)地黑茶與其他產(chǎn)地茶進行識別。

圖2 湖南安化黑茶與其他產(chǎn)地茶葉的PLSS--DDAAFig. 2 PLS-DA plot of Hunan Anhua dark tea and those from other regions

2.5 逐步判別分析

從茶葉樣品中各元素指標的方差分析、PCA和PLS-DA結(jié)果可以看出，利用元素指紋圖譜分析技術對湖南安化黑茶的原產(chǎn)地判別可行。為進一步了解各元素含量對黑茶產(chǎn)地的判別情況，對19 種特征元素含量的標準化數(shù)據(jù)按照統(tǒng)計量Wilk's λ最小值原則選擇變量，進行逐步判別分析，建立判別方程。結(jié)果顯示Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na 7 種元素先后被引入判別模型中，所建立的判別模型如下：

類別1（湖南安化黑茶）=－5.274－0.406（Li）－5.371（Pb）+6.173（Ga）－1.480（Ce）－5.052（Rb）－4.513（Cs）－1.201（Na）

類別2（云南普洱茶）=－10.139－10.639（Li）+2.742（Pb）－5.568（Ga）+0.050（Ce）+3.463（Rb）+0.288（Cs）+3.846（Na）

類別3（廣西六堡茶）=－33.465+0.228（Li）+6.700（Pb）－12.156（Ga）－3.591（Ce）+17.773（Rb）+11.232（Cs）+2.167（Na）

類別4（湖北青磚茶）=－16.329－4.953（Li）+10.681（Pb）－6.363（Ga）+12.182（Ce）－4.213（Rb）－1.005（Cs）－0.239（Na）

利用此模型對樣品進行歸類，進行回代檢驗和交叉驗證分析（表7），回代檢驗判別率為100%，交叉驗證判別率為98%，說明Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na這7 種元素指標對黑茶產(chǎn)地判別效果好。熟度較高，且礦物質(zhì)集中的成熟葉、莖、梗一同作為原料發(fā)酵，礦質(zhì)元素含量比其他茶類較高。黑茶原料黑毛茶采摘的時節(jié)、級別、樹種等對茶葉的元素含量也存在影響。再次，可能與安化黑茶獨特的加工工藝有關。安化黑茶最具特征的工序是在初制進程中的“渥堆”發(fā)酵工序與“松柴明火”干燥工序及在精制過程中“渥堆”等過程，都對茶葉元素含量都存在一定的影響?？傊枞~元素含量指紋特征是土壤環(huán)境、工藝、原料、茶樹等多種因素的綜合影響結(jié)果。因此，需要進一步研究分析安化黑茶的產(chǎn)地土壤環(huán)境、原料品種、加工工藝、茶樹種類等對黑茶元素含量的影響，才能更加系統(tǒng)闡述和探究安化黑茶礦物質(zhì)元素指紋特征的形成原因，為安化黑茶的產(chǎn)地溯源分析提供理論基礎和技術參考。

表7 黑茶產(chǎn)地判別分析Table 7 Classi fication with discriminate analysis of dark tea samples

4 結(jié) 論

3 討 論

本研究采用ICP-MS法得到湖南安化黑茶的元素含量指紋圖譜信息，能夠較好地表征安化黑茶原產(chǎn)地特征。不同產(chǎn)地黑茶樣品微量元素種類基本相同，但一些元素含量差異顯著。各產(chǎn)地黑茶有著各自的特征元素，相鄰地區(qū)樣品元素含量和特征元素相近，如湖南與湖北黑茶元素含量較為接近，云南與廣西黑茶元素含量相近。安化黑茶中微量元素種類較豐富，其中含量較高最具代表的礦物元素為P、Cu、Al、K、Cr、Ca、Mn、Fe、Zn、Ba、Na、Mg，其中Zn、Mn、Cu為超氧化物歧化酶的構成元素，具抗氧化作用，含量分別高達35.529、1 471.8、19.039 mg/kg，對人體健康大有益處；稀土元素的含量較低，如Cs、Gd、Sm、Nd、La、Ce、Pr等，過量的稀土元素會影響茶葉的品質(zhì)危害人體健康[28-29]。與其他產(chǎn)地黑茶存在明顯差異的特征元素為稀土元素（以Ce為突出代表，以及Cs、Gd、Sm、Nd、La、Pr等），以及被引入判別模型的堿金屬元素Li、Na、Rb、Cs。安化黑茶以上顯著性元素特征可能與安化縣茶葉生長土壤相關。安化縣內(nèi)土壤以板頁巖風化發(fā)育的土地面積最廣，茶園土質(zhì)較好，土壤以酸性和弱性為主，酸堿度適宜，養(yǎng)分含量較高[30]。這些特征元素能夠較好地表征安化黑茶原產(chǎn)地特征，可以作為鑒別安化黑茶產(chǎn)地的重要技術指標。

“安化黑茶”作為地理標志保護產(chǎn)品，主要指產(chǎn)自于湖南省安化縣內(nèi)特定生長區(qū)域，采用安化雪峰山脈茶區(qū)的大葉種群體品種為原料，經(jīng)過四大復雜的工藝加工而成，具有明顯的地域性[30]。首先植物中礦物元素含量特征與其產(chǎn)地環(huán)境中礦質(zhì)元素的含量密切相關。安化黑茶元素含量與安化地域獨特的地理位置和土質(zhì)有關，氮、鉀和硒等有機質(zhì)含量豐富。其次，可能與安化黑茶的加工原料黑毛茶有關。安化黑茶采制原料黑毛茶的成

本實驗采用ICP-MS對安化黑茶及其他產(chǎn)地黑茶中的B、Li、P等48 種元素組分進行定量分析，得到黑茶元素指紋圖譜。利用方差分析得到具有顯著性差異的元素有Li、Pb、Ga等19 種，云南和廣西由于地理位置較近，所測元素含量都較接近，4 個產(chǎn)地黑茶中湖北產(chǎn)地黑茶所測的元素含量大部分偏高；利用PCA和PLS-DA對湖南安化黑茶與其他產(chǎn)地黑茶類別進行判別分析，得到主成分得分投影圖和PLS-DA圖，各個產(chǎn)地的黑茶樣品在各自特征區(qū)域聚集較明顯，能對湖南安化黑茶與其他原產(chǎn)地黑茶進行有效區(qū)分和識別；采用逐步分析得到4 個產(chǎn)地判別模型，其中被引入產(chǎn)地判別模型的元素有7 種，依次為Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na，所建立的判別模型對樣品回代檢驗判別率為100%，交叉驗證判別率為98%。結(jié)果表明基于元素指紋圖譜結(jié)合化學計量學統(tǒng)計方法對湖南安化黑茶的原產(chǎn)地判別可行。