屠宰、預冷和市售階段豬肉及內臟中獸藥殘留分析與風險評估

馬 寧，王 杰，裴 斐，方 勇，楊文建，胡秋輝*

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

中國是豬肉消費大國，年消耗量接近全球總量一半，是人民日常飲食中必不可少的組成部分[1]。近年來，接連曝出“瘦肉精”、“病死豬肉”等事件引起了全社會的廣泛關注，肉制品監管成為了民眾熱切關心的話題。抗菌類藥基于其廣譜抗菌性和廉價性是目前最為常用的獸藥，其中根據合成方式可分為微生物分泌的天然抗生素（以四環素類、大環內脂類和β-內酰胺類為代表）和合成抗生素（以磺胺類、喹諾酮類為代表）。隨著 政府部門的監督管理的加強，鹽酸克侖特羅等禁用藥物正在逐漸減少，而抗菌類藥物由于其規定的最高殘留限量值較為寬松，其檢出率近年來有增加的趨勢，養殖戶如果未能嚴格遵守休藥期規定則會容易引起殘 留量檢出或超標[2-4]。養殖過程中使用獸藥無法避免，但是非法使用禁用藥、過量使用限量藥、不遵守休藥期規定、屠宰前用藥的情況普遍存在。研究表明，抗菌類獸藥具有致癌、致畸、致突變性，長期食用超過每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）的食品，會導致各種急慢性中毒。此外，畜禽長期過量服用某類獸藥會產生耐藥菌株，影響其臨床效果[5-7]。因此對豬肉產品中磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內脂類和β-內酰胺類藥物進行檢測和風險評估十分必要。

QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe）方法是在分散固相萃取技術基礎上開發的一種前處理技術[8-10]。該方法一般以乙腈或酸化乙腈作為提取劑，NaCl、無水Na2SO4等無機鹽作為吸水劑，C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）等聚合物作為吸附劑吸附干擾物[11-13]。Martínez-Villalba等[14]使用甲醇-乙腈提取，MgSO4-PSA凈化，檢測了飼料和動物源性食品中抗寄生蟲藥殘留，回收率為65%～95%。León等[15]使用0.1%乙酸-乙腈作為提取劑，NaCl、MgSO4、磁性吸附劑作為凈化劑，檢測了飼料中77 種獸藥殘留，回收率達80%～120%的良好效果。QuEChERS方法省時、操作簡便、提取效果好，但是該方法研發之初是以果蔬為目標基質，對于脂含量較高的動物源性食品的應用還需要進一步探索優化。目前由安捷倫公司推出的一款新型萃取鹽包作為增強型脂質去除技術（enhanced matrix removal lipid，EMR-L）改進QuEChERS方法的去脂能力。Anumol等[16]在三重四極桿和飛行時間質譜平臺上比較E MR-L與分散固相萃取技術，結果顯示EMR-L不論處理不同樣品還是在不同質譜平臺檢測，都具有明顯優勢。Zhao Limian等[17]對EMR-L進行優化，提出兩步萃取法對豬肉中獸藥殘留進行檢測，結果顯示有90%以上的藥物回收率在60%～120%之間。

國內外對食品安全評估方法的研究大多遵循以下4 個步驟：危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述[18-20]。其中暴露評估是食品安全評估的關鍵，包括物理、化學和生物性危害風險評估[21]。決策評估法是歐洲評估膳食化學物風險的常用方法，尤其適用于單一殺蟲劑，但是不適合用于整體人群的風險評估[22]。相對潛力因子評估是對膳食化合物的暴露評估、特別是殺蟲劑的風險評估方法。Sharma等[23]對有機磷酯、氨基甲酸酯等進行風險評估，認為該方法只能在具有劑量累計效應時使用。本研究采用Thomas等[24]的食品安全指數（food safety index，IFS）評估模型，通過比較人體污染物實際攝入量與安全攝入量評估食品中某種化學殘留對消費者健康影響。張聞娟等[25]使用IFS模型對雞肉中磺胺類藥物進行積累性暴露評估，研究表明該模型適用于整體人群的風險評估。

目前，對動物源性食品中獸藥殘留的研究主要集中在檢測技術手段，生豬從屠宰—預冷—物流銷售環節中的磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內脂類和β-內酰胺類等獸藥殘留分析及風險評估尚屬空白。本研究選取江蘇南京為研究區域，隨機抽檢 某屠宰 場屠宰、預冷階段肌肉、內臟等樣本240 份，及南京市4 個地區480 份市售豬肉樣品，采用EMR-L方法提取凈化，超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF/MS）分析檢測，并使用IFS模型評估南京市豬肉中磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內脂類和β-內酰胺類藥物殘留水平和風險水平，旨在為相關部門執法和監管提供科學依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸、正己烷（均為色譜純）德國Merck公司；EMR-Lipid QuEChERS萃取鹽包美國Agilent公司。

43 種標準品：磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺喹惡啉、磺胺氯噠嗪、甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺苯酰、磺胺醋酰、磺胺苯吡唑、環丙沙星、克林沙星、恩諾沙星、氟甲喹、洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、惡喹酸、培氟沙星、依諾沙星、萘啶酸、西諾沙星、二氟沙星、奧比沙星、司帕沙星、吉他霉素、泰樂霉素、四環素、土霉素、金霉素、強力霉素、青霉素V、阿莫西林、氨芐西林、頭孢拉定美國Sigma公司（純度≥99%）。分別準確稱取適量標準品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋，配制成質量濃度為1 000 mg/L的單標儲備液，置于－20 ℃冰箱中貯存，保存期限為1 個月。根據需要將上述儲備液混合稀釋成不同質量濃度的混合標準溶液，現用現配。

1.2 儀器與設備

Triple TOF 5600+飛行時間質譜儀（配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）及Analyst1.7數據處理系統） 美國AB公司；Nexer系列UPLC儀（包括DGU-20A5R脫氣機、SIL-30AC自動進樣器、SPDM-20A紫外檢測器、CTO-30A柱溫箱及LC-30AD溶液輸送單元） 日本島津公司；Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm） 美國Agilent公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；DL-5C離心機 上海安亭科學儀器廠；T18均質機德國IKA公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；Quintix125D-1CN十萬分之一天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選擇某屠宰場作為屠宰和預冷階段豬肉樣本采集場所，該屠宰場豬肉商品長期銷往南京各區，日均屠宰量約為1 500 頭。根據NY/T 1897—2010《動物及動物產品獸藥殘留監控抽樣規范》屠宰動物計算抽樣的方法，屠宰量為501～2 000 頭時，抽樣個數為10 份，不同部位在屠宰和預冷階段隨機抽樣，抽樣部位如圖1所示（肌肉組織代表性內臟：豬肝、豬腎），現取現測。

圖1 豬肉組織樣品抽樣分布圖Fig. 1 Picture for sampling distribution of porcine carcass

本實驗將南京市分為4 個地區進行抽樣分析，根據上述抽樣部位，每個地區抽樣10 份共480 份樣品。具體抽樣地區為：A棲霞區；B浦口區；C南京市區包括建鄴區、雨花臺區、白下區、玄武區、鼓樓區和秦淮區；D江寧區。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取方法

分別稱取2 g（精確至0.1 g）均質后的豬肉、豬肝和豬腎加入至含有10 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液的50 mL離心管中。渦旋混勻5 min后40 ℃超聲水浴10 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.3.2.2 凈化方法

將5 mL超純水加入EMR-L dSPE管中，渦旋15 s使其充分活化。取5 mL上清液立即加入活化后的EMR-L dSPE管中，渦旋5 min，40 ℃超聲水浴10 min，以4 000 r/min離心5 min，收集5 mL上清液加入EMR-L Polish管中，重復上述渦旋、超聲及離心步驟，取上層清液過0.22 μm濾膜待測。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。流動相A：0.1%甲酸溶液；流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～2.5 min，95%～45% A，5%～55% B；2.5～5 min，45%～10% A，55%～90% B；5～7 min，10%～95% A，90%～5% B。

1.3.3.2 質譜條件

ESI正離子模式，離子源溫度550 ℃；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣流速40 μL/min；輔助加熱氣流速40 μL/min；氣簾氣流速20 μL/min；去簇電壓100 V；離子富集時間0.05 s；掃描范圍m/z100～1 000質譜采集參數見表1。

表1 43 種獸藥的質譜采集參數Table 1 Parameters for UHPLC-MS MS analysis of the 43 veterinary drugs

續表1

1.3.4 風險評估

由于化學污染物的毒害作用與其進入人體的絕對量有關，所以采用IFS評價某種食品是否安全應以人體對污染物的實際攝入量與其安全攝入量比較更為科學合理[26-28]。在全面考慮研究的消費者人群飲食習慣及各種食品和化學物質的殘留情況下，IFS值具備加和性。因此本研究采用IFS值評估豬肉在屠宰加工過程中磺胺類和喹諾酮類藥物對人群的危害程度，采用平均值評估消費人群的安全狀態[29]。計算如式（1）～（3）所示：

式中：EDIC為目標化合物實際攝入量的估算值；Ri為樣品i中目標化合物殘留量/（μg/kg）；Fi為樣品i估計日攝入量/（kg/（人·d））；Ei為樣品i的可食用部分因子；Pi為樣品i的加工處理因子；SIC為目標化合物的每日允許攝入量；bw為人體平均質量/kg；f為校正因子；n為檢出獸藥種類。根據國際食物政策研究所2017年的統計數據顯示2016年中國人均豬肉消費量約為56 kg，因此，本實驗中Fi值按0.15 kg/（人·d）計算（56/365=0.153 kg），人均體質量按60 kg計算，f、Ei和Pi按1計算。

IFSC大于1表示目標化合物對食品安全的風險較高不可接受，必須采取相應預防措施；IFSC小于等于1表示目標化合物對食品安全的風險可接受；IFSC遠小于1表示目標化合物對食品安全沒有影響。大于1表示消費人群的安全狀態不可接受；小于等于1表示消費人群的安全狀態可接受；遠小于1表示消費人群的安全狀態良好[30]。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 標準曲線和線性范圍

制備基質標準曲線與對應質量濃度的溶 劑標準曲線（加標量1、5、10、20、50、100 μg/kg）。以定量離子峰面積（y）為縱坐標軸，質量濃度（x，μg/L）為橫坐標繪制工作曲線，得到豬肉產品中線性回歸方程的相關系數r均大于0.99，表明經過3 種方法處理過的43 種獸藥在1.0～100.0 μg/L范圍內線性關系良好。

2.1.2 檢出限和定量限

以3 倍信噪比計算得到檢出限為0.25～1.5 μg/kg，10 倍信噪比算得定量限為0.5～6.0 μg/kg，證明本方法滿足對實際樣品痕量分析。

2.1.3 回收率和精密度

取空白樣品加入43 種獸藥混合標準溶液，配制成5、10、20 μg/kg三個水平的添加樣品各6 份，進行回收率實驗，平均回收率為69.8%～112.4%，相對標準偏差為2.4%～14.9%，均滿足殘留限量檢測標準。

2.2 屠宰和預冷階段豬肉產品中43 種獸藥殘留水平

屠宰過程豬肉產品中43 種獸藥的檢出情況如表2所示。240 份豬肉產品中有4 份磺胺二甲嘧啶檢出，殘留量為15.91 μg/kg和3.98 μg/kg（預冷：14.87、3.16 μg/kg），未超過國家規定的最高殘留限量25 μg/kg。此外有2 份二氟沙星在豬肝中檢出，殘留量為19.03 μg/kg（預冷：15.26 μg/kg），未超過國家規定的最高殘留限量800 μg/kg。在豬肉及內臟樣品中，有6 份恩諾沙星檢出，殘留量分別為14.84、3.87 μg/kg和19.94 μg/kg（預冷：13.61、2.43 μg/kg和18.71 μg/kg），均未超過國家規定的最高殘留限量100 μg/kg。本次采樣中43 種獸藥檢出率為5%。

表2 43 種獸藥檢出情況Table 2 Detection rates of 43 veterinary drugs during slaughter and pre-cooling

2.3 屠宰和預冷階段豬肉產品中43 種獸藥風險評估

通過IFS進行殘留評估，如表3所示。磺胺二甲嘧啶EDI分別為2.39、0.60 μg/（人·d）（預冷：2.23、0.47 μg/（人·d））；二氟沙星EDI為2.85 μg/（人·d）（預冷：2.29 μg/（人·d））；恩諾沙星EDI分別為2.23、0.58 μg/（人·d）和2.99 μg/（人·d）（預冷：2.04、0.36 μg/（人·d）和2.81 μg/（人·d））。其中有2 份恩諾沙星檢出樣品的EDI大于最大攝入量（2 μg/（人·d））。IFS范圍為9.00×10－4～4.83×10－2，均遠小于1，表明本實驗研究的43 種獸藥殘留對南京市地區豬肉的食品安全沒有影響。

表3 3 種獸藥的ADI、EDI及IFSTable 3 ADIs, EDIs and IFS for three veterinary drugs

2.4 南京市售豬肉產品43 種獸藥殘留與風險評估

為了系統評估豬肉產品中43 種獸藥對消費人群的影響，本實驗選取南京市4 個地區的各大超市作為采樣地點，按1.3.1節抽樣分布圖，每個區分別抽取12 種不同部位豬肉樣品各10 份，共抽樣480 份。如表4所示，在本次抽樣中，共有磺胺二甲嘧啶、二氟沙星、氟甲喹、恩諾沙星、沙拉沙星5 種藥物檢出，均未超過國家規定的最高殘留限量，檢出率為4.4%。按1.3.3節方法計算EDI與IFS值（表5），結果顯示，IFS為1.6×10－3～5.94×10－2，為4.08×10－3～1.27×10－2，均遠小于1，表明南京市4 個區市售豬肉中43 種獸藥殘留的安全狀態可以接受。值得注意的是，對于恩諾沙星和沙拉沙星這類ADI值較低的物質，在A（棲霞區）、C（市區）和D（江寧區）檢出樣品中低于其EDI值。

表4 南京市售豬肉檢出情況Table 4 Detection rates of 43 veterinary drugs in pork samples sold in Nanjing

表5 南京市售豬肉殘留的ADI、EDII及IIFFSSTable 5 ADIs, EDIs and IFS for pork residues in pork samples sold in Nanjing

3 結 論

本實驗根據NY/T 1897—2010隨機抽取240 件樣品，抽樣部位包括肌肉組織和內臟組織等12 種。運用EMR-L方法提取凈化，UHPLC-Q-TOF/MS檢測屠宰和預冷階段43 種磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內脂類和β-內酰胺類獸藥殘留，并進行風險評估。結果表明，43 種獸藥中有磺胺二甲嘧啶、二氟沙星和恩諾沙星檢出，檢出率為5%，含量為2.43～19.94 μg/kg。其中，1 份后腿肉及1 份豬腎樣品中恩諾沙星每日暴露量大于最大攝入 量。本實驗采用IFS評價43 種獸藥對消費人群健康的影響，IFS值均遠小于1，表明南京市豬肉產品中43 種獸藥殘留的安全狀態可以接受。通過追蹤抽檢預冷樣品發現，檢出樣品經尸僵、成熟后檢測結果與屠宰時差異不明顯，說明在屠宰和預冷階段中沒有43 種獸藥的二次污染。

本實驗同時對南京市4 個地區市售豬肉進行抽樣檢測，總計480 份，檢出率為4.4%，IFS與值均遠小于1，表明南京市售豬肉產品中磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內脂類和β-內酰胺類藥物殘留量對人群健康不會造成危害效應，監管部門不必采取風險管理程序。但值得注意的是，豬耳及后腿肉中藥物檢出率較高，這是由于肉豬給藥方式一般為臀部肌肉注射和耳靜脈注射。與此同時，恩諾沙星和沙拉沙星此類ADI較低的藥物，其EDI值易高于ADI值，反映出養殖戶需要進一步嚴格執行休藥期規定，以及本市食品監管存在一定安全隱患，政府部門需要加強對此類藥物監管。